磺胺嘧啶银单独及联合水蛭素治疗深 Ⅱ 度烧伤大鼠的效果对比▲

梁钟帅 唐汶滤 冯清媚 祁新梅 林彩星 石展英 丁华荣

(1 柳州市工人医院创伤骨科,广西柳州市 545007; 2 广西医科大学研究生院,广西南宁市 530021; 3 广西医科大学第一附属医院烧伤整形外科,广西南宁市 530021 )

深 Ⅱ 度烧伤是临床上常见的烧伤类型,损伤可达真皮层,但残余真皮及皮肤附件残留,因而具有较大的可转化性[1]。目前深 Ⅱ 度烧伤常用的治疗方案包括烧伤敷料覆盖、局部应用银离子抗感染、行清创术清理坏死组织、皮肤移植及外源性生长因子促进愈合等[2]。但上述方案均存在一定的局限性,例如银离子残留具有细胞毒性、清创术可破坏残留的真皮及皮肤附件、自体皮源缺乏等,因此治疗效果均不理想,导致创面愈合时间仍较长[3]。磺胺嘧啶银(silver sulfadiazine,SSD)是临床上常用的一种局部抗菌制剂,其通过磺胺嘧啶和银离子的抗菌作用来防止烧伤创面感染,进而促进创面愈合,因此常作为治疗烧伤的外用药物[4-5]。但是,SSD也会造成正常组织和细胞的损伤,延缓烧伤伤口的愈合,同时银离子还会被人体吸收,存在引发肝肾功能损害的风险[6]。因此,对于是否使用SSD治疗烧伤创面,目前仍存在一定的争议。当皮肤被烧伤后,表皮坏死,深层的微血管也受到热损伤,出现微血管功能异常及微血流的改变,同时血管内皮细胞释放相关凝血因子,在微循环中形成微血栓,严重时还会出现弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)[7]。目前,如何改善残余创面的微环境,帮助创面基底部残余皮肤附件的细胞增长并加速创面愈合,是该领域的研究热点之一[8-10]。水蛭素是目前已知的强抗凝药,可与凝血酶直接作用发挥抗凝血作用,抑制血栓形成,其所含的抗炎酶还具有抗炎作用[11-12]。此外,水蛭素能抗血小板聚集,促进血管内皮生长因子表达,在皮瓣移植和断指再植中有明显疗效[13-14]。然而,水蛭素能否抑制烧伤引起的局部微血栓形成、烧伤所引起的炎症反应及凝血酶的激活,促进烧伤伤口的愈合,目前的研究报告仍较少。本研究通过建立深Ⅱ度烧伤大鼠模型,应用SSD单独或联合水蛭素进行治疗,进一步验证单纯使用SSD是否可导致烧伤创面延迟愈合,同时初步了解SSD联合水蛭素治疗是否可减轻SSD的副作用而获得更好的治疗效果,从而为深Ⅱ度烧伤的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只SD雄性大鼠由广西医科大学实验动物中心提供[动物生产许可证号为SCXK(桂)2009-0002,动物使用许可证号为SCXK(桂)2009-0004],4月龄,体重为170～200 g。将大鼠饲养于符合医学实验动物环境设施要求的饲养环境,室温18 ℃～25 ℃,相对湿度40%～70%,噪音<65分贝。本实验遵循广西医科大学动物伦理委员会的有关规定。

1.2 主要试剂及仪器 5 ATU/mL的天然水蛭素(广西南宁知博赛尔生物技术有限公司,生产批号:2016CC4521),凡士林(河南亚都实业有限公司,生产批号:2011CC3635),SSD乳膏(广西医科大学第一附属医院制,桂药制字H01060297),林格氏液(安徽双鹤药业有限责任公司,国药准字H20033736), 水浴箱[上海赫田科学仪器有限公司,型号:HH-US-A(20L)]。

1.3 造模方法 参照相关文献[4,15]的建模方法进行预实验,发现大鼠的烧伤创面与正常组织的分界清楚,创面高出正常皮肤,创面潮湿、质感较硬,随着时间的延长,创面色泽变暗,颜色由白转为灰白,为深Ⅱ度烧伤表现,因此本实验以该法建模。将30只SD大鼠适应性喂养1周后,用7%水合氯醛(0.5 mL/100 g)进行腹腔注射,麻醉起效后,剪去腹部长毛,用配制好的8%硫化钠褪毛,60 s后用温水冲洗涂擦部位,擦除皮肤上的脱毛剂,分笼喂养,自由进食进水。24 h后将大鼠再次麻醉,固定在烫伤模具上,腹部透过模具空洞行热水浴(水温为90 ℃,持续10 s),致伤后立即用无菌干纱布拭干,从而得到腹部直径约2.7 cm的圆形深Ⅱ度烧伤创面。致伤后立即给予各组大鼠腹腔内注射林格氏液3 mL抗休克。最终观察到与预实验相似的皮肤表现,即造模成功,共25只大鼠造模成功(另5只大鼠因麻醉死亡)。

1.4 分组及治疗方法 致伤后将大鼠按随机数字表法分成A组(8只)、B组(9只)、C组(8只)。在烧伤治疗中凡士林是主要用于保护创面,故仅使用凡士林均匀涂抹A组大鼠创面,不给予其他干预;使用SSD乳膏均匀涂抹B 组和C组大鼠创面,并在C组大鼠腹部近头端和腹部两侧,距离创面中心4.0 cm的部位注射水蛭素5ATU。每天给予各组大鼠常规换药并涂药治疗,1次/d,同时每3 d用手机拍照记录伤口情况,大鼠创面愈合后停止涂药。给予C组大鼠每3 d注射1次水蛭素,共注射5次,于致伤后第15天停止注射。

1.5 观察指标 观察各组大鼠的一般情况及创面愈合情况,并拍照记录,根据已拍摄的照片,使用Adobe PhotoShop CC 2018软件测量创面面积,计算创面愈合率,创面愈合率=[(原创面总面积-未愈合创面面积)/原创面总面积]×100%。由于造模当天烧伤组织周围红肿,具体的坏死组织范围不确切,因此本研究待烧伤急性期过后,以坏死组织边界清楚的第4天作为初始原创面积的评估时间点,以减少误差。记录每组大鼠创面愈合所需时间,愈合的标准为痂壳小于原始创面的5%,即愈合率大于原始创面的95%。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠一般情况的比较 A组部分大鼠在致伤后第3天开始出现打喷嚏、呼吸不畅现象,在致伤后第9天有2只大鼠出现明显的活动能力减弱,进食和饮水有所减少,并有痰鸣音、寒战表现,怀疑肺部感染,其中1只在出现症状当天死亡,另1只逐渐自行好转。B组大鼠在致伤后第3天开始出现密集打喷嚏、呼吸不畅,有痰鸣音、张口呼吸现象,感染较严重,其中1只大鼠在出现症状当天死亡。而C组仅有2只大鼠在致伤后第3天出现轻度打喷嚏现象,并未出现死亡。

2.2 3组大鼠创面愈合情况的比较 致伤后当天,3组大鼠创面颜色、大小、范围、深度大致相同。致伤后第4天,3组大鼠创面干燥结痂,坏死组织边界清晰,A组和C组大鼠创面底部淤血较少,B组大鼠创面可见明显的淤血。致伤后第7天,3组大鼠创面干燥结痂,基底部肉芽组织增多,外周坏死组织逐渐愈合,但A组和B组大鼠创面基底部可见较多淤血,微血栓较多,而C组大鼠创面微血栓较少。致伤后第13天,A组和C组大鼠创面痂皮脱落,组织趋向愈合,并且C组愈合效果更好;B组大鼠创面仍有痂皮覆盖,烧伤创面仍较大,淤血较多,创面深度仍较深。致伤后第15天,B组大鼠创面痂皮脱落,而A组及C组大鼠创面愈合情况良好,且疤痕组织不明显。致伤后第18天,A组及C组创面较前明显缩小,无明显渗出,部分大鼠创面已愈合。见图 1。

图1 各时间点 3组大鼠创面的愈合情况

2.3 3组大鼠创面愈合时间的比较 剔除死亡大鼠后,A组、B组、C组最终分别纳入7只、8只、8只大鼠进行统计,其愈合时间分别为(18.29±0.48)d、(19.50±1.06)d、(18.75±1.03)d,3组间差异无统计学意义(F=3.079,P=0.068)。但A组在致伤后第18天已有部分大鼠的创面愈合,在致伤后第19天所有大鼠的创面均愈合;B组在致伤后第7天仍有大鼠出现伤口面积较前扩大的情况,在致伤后第18天有部分大鼠的创面已愈合,在致伤后第21天仍有1只大鼠的创面仍未愈合;C组在致伤后第16天有部分大鼠的创面已愈合,在致伤后第19天仅有1只大鼠的创面未完全愈合,但在第20天达到愈合。

2.4 3组大鼠创面愈合率的比较 与B组相比,A组大鼠在致伤后第10天、第18天和19天的愈合率均更高,C组大鼠在致伤后第10天、第13天、第18天和第19天的愈合率均更高(均P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠不同时间点愈合率的比较(x±s,%)

3 讨 论

3.1 SSD导致烧伤创面延迟愈合 SSD通过缓慢持续地释放磺胺嘧啶和银离子,达到持续抗菌的目的。研究表明,SSD能有效抑制包括铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在内的多重耐药菌感染[16]。Ulkür等[17]通过比较SSD与其他抗菌敷料对大鼠全皮肤铜绿假单胞菌污染的烧伤创面的局部抗菌作用,发现SSD的抗菌效果优于其他抗菌敷料。柴胜武等[18]将SSD应用于162例烧伤患者创面,发现患者感染率低,治疗效果满意。然而,近年来越来越多的研究表明SSD在预防感染和促进愈合方面的效果欠佳。例如,Storm-Versloot等[19]通过荟萃分析发现,没有足够的证据表明含银离子的敷料能够促进伤口愈合或预防伤口感染。另外,Genuino等[20]通过随机对照试验发现,与SSD相比,凡士林敷料在促进组织上皮化方面的效果更佳,且更换敷料更方便。Lee等[21]发现SSD虽能控制感染,但延缓了伤口的愈合,其原因主要是SSD对真皮细胞的细胞毒性作用导致真皮再生障碍和真皮组织机械强度降低。本研究结果显示,与A组大鼠相比,B组大鼠创面淤血持续时间更长,痂皮脱落更慢,部分时间点的愈合率更低,所有大鼠创面均愈合所需时间更长。由此可见,单纯使用SSD可导致深Ⅱ度烧伤大鼠模型的创面愈合延迟,与上述研究结果相似。而创面愈合不佳又可增加感染的风险,减弱SSD的抗菌效果,因此本研究中A组和B组的部分大鼠一般情况较差,有肺部感染征象,且出现死亡的情况。

3.2 SSD联合使用水蛭素可促进烧伤创面愈合 在深Ⅱ度烧伤创面中,存在3个病理区域带,分别是凝固坏死带(位于最中心)、充血水肿带(位于外周)、淤滞带(位于中间部分)。其中,淤滞带属于间生态组织,为危险区域,淤滞带的微循环血流部分受阻,这导致微静脉扩张和微静脉内血流停滞,从而使血小板、红细胞和白细胞附着于血管壁,并逐渐阻塞管腔[7,22-23]。如果在烧伤后48 h内未能恢复烧伤创面的微循环,会导致间生态组织血流灌注减少、微血栓形成及间生态组织坏死,进而加重创面损伤,甚至发展为Ⅲ度烧伤创面[24]。研究表明,尽早恢复淤滞带的血流,间生态组织即有机会转变为具有活力的组织,从而促使创面愈合[25- 26]。由此可见,深Ⅱ度烧伤创面的愈合与局部微循环状态密切相关。因此,抗凝血剂和抗炎剂已被用于挽救瘀滞带,且取得良好的效果[27-28]。水蛭素是目前已知的强抗凝药,本研究采用SSD联合水蛭素治疗烧伤创面,观察其干预效果。结果显示,与A组、B组大鼠相比,C组大鼠的整体状况较佳,仅个别大鼠存在轻微的感染症状,且无大鼠死亡;与B组大鼠相比,C组大鼠的创面淤血情况和微血栓程度更轻,在致伤后第16天已有部分大鼠的创面愈合,部分时间点的愈合率更高。这说明SSD联合水蛭素能够促进深Ⅱ度烧伤创面愈合,同时可降低感染风险。研究表明,低分子肝素通过改善微循环来实现毛细血管再通和淤滞带再灌注,同时能够通过调节相关炎症因子来增强机体细胞免疫功能和吞噬细胞的吞噬能力,从而促进烧伤创面的愈合[29-30]。因此,我们推测水蛭素可能通过减轻微循环中的淤血和减少微血栓形成,来改善淤滞带的缺血情况,以挽救间生态组织,促进创面愈合,从而减轻SSD导致的创面延迟愈合的副作用,同时不影响SSD的抗菌效果。但水蛭素对烧伤创面中的炎症因子和血管内皮生长因子是否有影响,仍需要进一步研究探讨。

3.3 本研究的局限性 (1)由于实验条件有限,本研究未对大鼠模型进行病理验证,仅参考相关文献来确定深Ⅱ度烧伤模型的建模情况。(2)水蛭素需要通过注射给药的方式使用,可能对周围的肉芽组织造成再次损伤,而其他两组未接受注射,因此实验设计上存在一定的不足之处。(3)部分结果无统计学意义,可能与样本量较小有关。(4)由于实验动物数量有限,未设置单纯的水蛭素治疗组,未能进一步分析水蛭素与SSD的相互影响。

3.4 小结 综上所述,单纯使用SSD可能会导致深Ⅱ度烧伤大鼠模型的创面愈合延迟,而SSD联合水蛭素可以通过改善微循环来促进深Ⅱ度烧伤大鼠的创面愈合,且可降低感染风险。