基于NCOA4介导的铁自噬探讨大补脾汤对放射性肺损伤大鼠氧化应激的影响

张朝宁 ，张志明 ，余臣祖

1.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020；2.甘肃省中西医结合肿瘤临床医学研究中心，甘肃 兰州 730020

放射性肺损伤（radiation-induced lung injury，RILI）是胸部恶性肿瘤放疗最常见和最致命的并发症之一，发生率约15%[1]。RILI是限制放疗有效剂量的主要因素，严重影响放疗方案的顺利实施和治疗效果。RILI分为2个阶段，早期表现为渗出性炎症反应，即放射性肺炎，若继续恶化则在中晚期表现为放射性肺纤维化[2]。氧化应激是RILI的主要原因，放疗产生的活性氧（ROS）贯穿病程始终，对放射性肺炎和肺纤维化都有促进作用，因而抗氧化对RILI 治疗具有重要意义[3]。

近年研究显示，铁死亡也参与RILI发生过程[4]，铁死亡是Dixon等[5]发现的细胞死亡方式，以毒性脂质过氧化物累积所致氧化代谢失衡为特征。细胞内铁超载是铁死亡发生的基础，而过多的活性铁可由铁自噬产生。铁自噬是依赖核受体辅激活因子4（NCOA4）的新型自噬类型，铁自噬启动后，铁蛋白被输送到自噬小体，与溶酶体融合后降解为游离铁离子，通过芬顿反应产生大量ROS，导致铁死亡发生[6]。因此，抑制铁自噬调控铁死亡可能减轻氧化应激反应，为RILI防护提供新思路。

大补脾汤出自敦煌医学卷子《辅行诀脏腑用药法要》，有补益脾肺、益气滋阴之效。研究发现，大补脾汤对RILI有一定保护作用[7-8]。本实验基于NCOA4介导的铁自噬调控铁死亡探讨大补脾汤对RILI大鼠的抗氧化作用及作用机制，为RILI防护提供参考。

1 实验材料

1.1 动物

健康SPF级雄性SD大鼠30只，2～3月龄，体质量180～220 g，兰州大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（甘）2018-0002。饲养于兰州大学实验动物中心SPF 级实验室，温度20～25 ℃、相对湿度40%～70%，使用许可证号SYXK（甘）2018-0005。

1.2 药物及制备

大补脾汤（人参、炙甘草、干姜各15 g，白术、麦冬、五味子、旋覆花各5 g），饮片购自甘肃中医药大学附属医院中药房。由甘肃中医药大学中药制药实验室按传统煎药法煎煮2次，合并药液，以100目滤布过滤，滤液经旋转、蒸发、浓缩，按人与大鼠体表面积折算，配制成含原药材1.214 g/mL药液。参考前期研究基础[7]，按照上述药液浓度的0.5、2倍，再分别配制成0.607、2.428 g/mL药液，分装，4 ℃冷藏备用。

1.3 试剂

谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成生物工程研究所，货号分别为A005-1-2、A001-1-2、A003-1-2；亚铁离子（Fe2+）检测试剂盒，北京索莱宝生物工程有限公司，货号20 220014；ROS试剂盒，上海贝博生物科技有限公司，货号BB-470515-100T；谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、NCOA4、核因子E2 相关因子2（Nrf2）抗体，英国艾博抗公司，批号分别为A1933、A1956、A1375；铁蛋白重链1（FTH1）抗体，Immunoway公司，货号YT1692；BCA蛋白定量试剂盒、RIPA蛋白裂解液，北京索莱宝科技有限公司，货号分别为20210419、20 210911；电泳Marker、ECL发光液、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、TRIeasy，上海翊圣生物科技有限公司，货号分别为26616、36208-A/B、11141-C、11202ES08、10606ES60。

1.4 仪器

X射线辐射仪（美国Faxitron公司，型号RX650），包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号JB-P5），病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016），组织摊片机（金华科迪仪器设备有限公司，型号KD-P），显微镜（日本OLYMPUS公司，型号BX43+sc50），组织匀浆器（美国Bio-Gen公司，型号PRO200），电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号DYY-6D），实时定量PCR 仪（美国Thermo 公司，型号StepOne Plus），转膜仪（北京六一生物科技有限公司，型号DYY-6D），NanoDrop核酸浓度测量仪（美国Thermo公司，型号ND-ONE-W），酶标仪（美国Bio-Rad 公司，型号iMark），恒温培养箱（澳柯玛股份有限公司，型号BC/BD-208HNE），高速低温台式离心机（德国Eppendorf公司，型号TGL-16）。

2 实验方法

2.1 分组及给药

采用随机数字表法将30只大鼠随机分为正常对照组、模型组和中药高、中、低剂量组，每组6只。中药高、中、低剂量组每日分别予大补脾汤药液2.428、1.214、0.607 g/mL灌胃，灌胃体积10 mL/kg，正常对照组和模型组每日灌胃等量生理盐水，连续14 d。

2.2 造模

除正常对照组外，其余各组于给药结束后予X射线单次照射。照射前用无菌生理盐水配制0.3%戊巴比妥钠溶液，按0.2 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠。参考前期研究方法[7-8]，在X射线模拟机下定位，照射野（右肺）2 cm×3 cm，铅皮屏蔽其余部位，用X射线辐射仪8 MeV 射线单次照射右肺，源皮距200 cm，剂量率1 Gy/min，均匀率96%，照射吸收剂量8 Gy。麻醉及照射过程中大鼠无死亡。

2.3 取材

照射后各组大鼠正常饲养，第7日过量麻醉处死大鼠，取出右肺，冰生理盐水冲洗，剪成3份：1份肺组织制成匀浆，按试剂盒说明书步骤检测Fe2+、GSH、MDA、SOD、ROS含量；1份放入相应冻存管，-80 ℃冰箱冻存，用于Western blot和qPCR检测；剩余肺组织用4%多聚甲醛固定，用于HE染色和免疫组化检测。

2.4 指标检测

2.4.1 HE染色

将4%多聚甲醛固定的右肺组织取出，经梯度乙醇脱水、石蜡包埋后切片，HE染色，脱水，透明，封片，显微镜下观察右肺组织病理改变。

2.4.2 免疫组化检测

右肺组织常规石蜡包埋、切片（厚度4 μm），经脱蜡、水化、抗原修复后，封闭，加Nrf2 一抗（1∶200）、NCOA4一抗（1∶300），4 ℃孵育过夜，加二抗（1∶1 500），37 ℃孵育1 h，DAB显色，脱水，封片。显微镜读片拍照，阳性染色为肺泡和肺间质出现棕褐色颗粒，Image Pro Plus 6.0软件计算平均光密度。

2.4.3 Western blot检测

取200 mg冷冻肺组织样本，加入RIPA蛋白裂解液提取蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，蛋白样本变性，SDS-PAGE，转膜，加入FTH1、GPX4一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，洗膜后加二抗，室温孵育1 h，化学发光仪中显影曝光，用Image J图像分析软件计算目的蛋白相对表达量（目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值）。

2.4.4 qPCR检测

采用Trizol法提取右肺组织总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA 为模板，进行qPCR。反应体系：qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA 1 μL，加无菌超纯水至20 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，共40个循环。以β-actin为内参，2-ΔΔCt法进行相对定量分析。引物由博迈德生物科技公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 统计学方法

4 结果

4.1 大补脾汤对模型大鼠右肺组织病理形态的影响

正常对照组大鼠右肺组织结构清晰，内部结构正常，无充血、纤维化等炎性改变；模型组大鼠肺泡壁断裂，肺泡塌陷变形，肺间质充血、出血、炎性细胞浸润并伴有少量纤维化；中药各剂量组大鼠右肺损伤较模型组减轻，中药高剂量组肺组织炎性细胞减少，充血、出血减轻，渗出减少，中药中剂量组少量出血，炎性细胞明显减少，中药低剂量组肺泡变形仍较严重，炎性细胞数量较多。见图1。

图1 各组大鼠右肺组织病理形态（HE染色，×200）

4.2 大补脾汤对模型大鼠右肺组织Fe2+、谷胱甘肽、丙二醛、超氧化物歧化酶、活性氧含量的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠右肺组织Fe2+、MDA、ROS含量明显升高，GSH、SOD含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，中药各剂量组大鼠右肺组织Fe2+、MDA、ROS含量明显降低，GSH、SOD含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），其中中药高剂量组变化更明显（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠右肺组织Fe2+、GSH、MDA、SOD、ROS含量比较（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

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4.3 大补脾汤对模型大鼠右肺组织核因子E2 相关因子2、核受体辅激活因子4、铁蛋白重链1、谷胱甘肽过氧化物酶4蛋白表达的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠右肺组织Nrf2、FTH1、GPX4蛋白表达明显降低，NCOA4蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，中药各剂量组大鼠右肺组织Nrf2、FTH1、GPX4蛋白表达明显升高，NCOA4蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表3、图2、图3。

表3 各组大鼠右肺组织Nrf2、NCOA4、FTH1、GPX4蛋白表达比较（±s）

表3 各组大鼠右肺组织Nrf2、NCOA4、FTH1、GPX4蛋白表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

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4.4 大补脾汤对模型大鼠右肺组织核因子E2 相关因子2、核受体辅激活因子4、铁蛋白重链1、谷胱甘肽过氧化物酶4 mRNA表达的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠右肺组织Nrf2、FTH1、GPX4 mRNA表达明显降低，NCOA4 mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，中药各剂量组大鼠右肺组织Nrf2、FTH1、GPX4 mRNA表达明显升高，NCOA4表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表4。

表4 各组大鼠右肺组织Nrf2、NCOA4、FTH1、GPX4 mRNA表达比较（±s）

表4 各组大鼠右肺组织Nrf2、NCOA4、FTH1、GPX4 mRNA表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

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5 讨论

肺对辐射较敏感，胸部恶性肿瘤患者接受放疗时正常肺组织不可避免被损伤而发生RILI，可能导致治疗中断，影响放疗效果。虽然RILI分为2个阶段，但临床中观察到RILI发病是一个连续过程，2个阶段并没有明确界线。RILI是多种机制综合调控、多因素相互作用的复杂过程，机制尚未完全阐明，缺乏有效治疗措施[9-10]。因此，开发理想的RILI防护药物对肿瘤临床放疗具有重要意义。

中医药具有整体调治、不良反应小等优点，是辐射防护领域的研究热点。放疗后患者正气大伤，阴阳不和，五脏不安，临床常见肺脾两虚或气阴两虚等证型。脾属土，脾土可以生金，肺脾同属太阴，生理病理上相互影响，治疗上亦相辅相成。培土生金法根据中医学五行相生理论“虚则补其母”原理，通过补益脾气达到补益肺气的作用。

大补脾汤主治脾气大疲、饮食不消、时自吐利、其人枯瘦如柴立不可动转，口中苦，干渴，汗出，气急脉微而时微者。方中人参益气生津，炙甘草、白术健脾益气，干姜温中健脾，麦冬益胃生津，五味子敛肺生津，旋覆花降逆止呕。诸药合用，共奏益气生津、补脾益肺之效。切合胸部恶性肿瘤患者因放疗射线损伤导致的肺脾气阴亏虚之病机特点。

氧化应激在RILI中起重要作用，是RILI的主要病理因素，也是RILI发生及病情进展的促进因素[11]。抗氧化损伤是近年来RILI防护研究的主要方向。本实验通过X射线照射大鼠右肺部建立RILI模型，选取GSH、MDA、SOD、ROS等氧化应激相关指标进行检测，结果显示模型组大鼠肺泡壁断裂，肺泡塌陷变形，肺间质充血、出血、炎性细胞浸润并伴有少量纤维化，表明RILI模型造模成功；肺组织MDA、ROS含量升高，GSH、SOD含量降低，提示大鼠发生氧化应激反应。大补脾汤可上调GSH、SOD水平，下调MDA、ROS水平，提示大补脾汤可抑制RILI大鼠氧化应激，提高其抗氧化能力，从而减轻肺组织炎性细胞聚集，改善RILI病理损害。

铁死亡以铁离子代谢失衡导致细胞内铁超载为基础，以GPX4表达降低为标志事件，通过芬顿反应引起毒性脂质过氧化物异常累积，进而对细胞产生氧化损伤[12]。GSH 水平正常时，GPX4 可抑制脂质过氧化，保护细胞不发生铁死亡，故GPX4活性降低是铁死亡发生的重要机制之一[13]。研究发现，铁死亡是RILI发生发展的重要促进因素，铁死亡诱导剂Erastin通过降低GPX4表达增加脂质过氧化，加快成纤维细胞分化，促进放射性肺纤维化病情进展。相反，铁死亡抑制剂可上调GPX4表达，抑制脂质过氧化反应及成纤维细胞分化，阻止RILI发展[14-15]。

铁蛋白是细胞内储存铁的蛋白复合物，不仅可以阻止细胞内产生过多的游离Fe2+，还可以在Fe2+水平降低时将储存的铁释放以维持铁稳态[16]。自噬是细胞在应激状态下降解代谢产物及细胞器的自我保护过程[17]。Mancias等[18]通过蛋白定量组学鉴定认为，NCOA4介导铁蛋白通过溶酶体进行降解并释放游离Fe2+，并把这一过程命名为铁蛋白自噬。NCOA4水平降低时，铁自噬水平也降低。铁自噬使大量游离Fe2+在细胞内聚集，通过芬顿反应产生大量ROS，导致细胞铁死亡。因此，抑制NCOA4 表达可减少铁蛋白降解，抑制铁死亡[19-20]。FTH1是组成铁蛋白的亚基之一，可调控铁储存并维持铁稳态，FTH1表达升高能抑制铁死亡，反之铁蛋白自噬使FTH1降解增加，则会升高铁水平而促进铁死亡，加重氧化损伤[21]。

Nrf2是细胞抗氧化损伤的主要因子之一，同时可通过调控下游靶基因GPX4表达参与调节铁死亡，与铁离子代谢、脂质过氧化及GSH代谢等铁死亡的重要环节密切相关[22]。研究发现，敲除Nrf2基因可加重RILI炎症及氧化损伤，过表达Nrf2则阻碍肺纤维化进展，对RILI有一定保护作用[23]。因此，通过Nrf2/GPX4调控铁死亡，缓解氧化应激是防护RILI的新靶点。

基于上述理论，推测大补脾汤减轻RILI大鼠氧化应激可能是通过铁自噬调控铁死亡，抑制细胞内游离Fe2+产生，进而缓解脂质过氧化反应而实现。选取Fe2+含量，NCOA4、FTH1、GPX4、Nrf2表达作为铁死亡的检测指标，结果显示，中药各剂量组大鼠右肺组织Fe2+含量、NCOA4表达较模型组降低，Nrf2、FTH1、GPX4表达升高。表明大补脾汤可通过下调NCOA4表达抑制铁自噬，减少铁蛋白降解，进而使FTH1表达升高，减少细胞中游离Fe2+释放，抑制细胞铁死亡，缓解氧化应激，改善RILI大鼠肺部病理损害，且高剂量大补脾汤效果更显著。

综上所述，大补脾汤可能通过抑制NCOA4介导的铁蛋白自噬，减少活性铁释放，减轻RILI肺组织铁超载，抑制细胞铁死亡，从而缓解RILI氧化应激，改善病理损害，发挥对RILI的防护作用。