胆红素代谢通路主要酶的基因多态性研究进展*

段改原,李宇晨,蒋 雪 综述,刘 玲 审校

1.昆明医科大学研究生院,云南昆明 650500;2.大理大学研究生院,云南大理 671000;3.云南省昆明市儿童医院新生儿科,云南昆明 650103

胆红素来源于体内的血红素,是血红蛋白及其他血红素蛋白在单核-巨噬细胞或其他网织内皮细胞及肝细胞中的代谢终产物。血红素在微粒体血红素氧合酶1(HO-1)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)及细胞色素c还原酶的作用下形成胆绿素,再由胆绿素还原酶(BLVR)还原为胆红素,此时的胆红素为未结合胆红素(UCB)。UCB在血液中与清蛋白结合形成复合体,经血液循环运输至肝脏的Disse腔后与清蛋白分离,分离后的UCB在有机阴离子转运肽2(OATP2)的作用下进入肝细胞,并与肝细胞胞质内的Y蛋白和Z蛋白结合,被运输至肝细胞滑面内质网,胆红素在此被尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDPGT)催化与葡萄糖醛酸进行1～2次结合反应,形成结合胆红素(CB),CB又经多药耐受相关蛋白2(MRP2)从肝细胞排出,并经胆道系统排入肠腔,其中,部分CB在肠道细菌的作用下分解为未结合胆红素,经肠肝循环再次入血。

总之,胆红素代谢是人体内一个复杂且受多因素影响的过程,代谢过程中任意一个环节异常均可引起血清胆红素升高,造成严重不良后果。据报道,高胆红素血症是新生儿常见的疾病之一。该病主要表现为皮肤、巩膜黄染,严重者可出现胆红素脑病和肝功能损伤等并发症,留下明显的后遗症。近年来,国内外学者对胆红素代谢酶基因多态性开展了广泛的研究,尤其是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、溶质载体有机阴离子转运蛋白1B1(SLCO1B1),这些编码基因突变将导致相应的酶或转运蛋白功能障碍,严重影响胆红素代谢。本文就国内外关于G-6-PD、UGT1A1、SLCO1B1、HO-1、BLVRA基因多态性研究进展进行总结。

1 G-6-PD

G-6-PD是人体内的管家酶,参与催化磷酸戊糖旁路途径产生NADPH,而NADPH是预防氧自由基引起细胞结构损伤的重要物质。因此,当G-6-PD缺乏或活性降低时会影响NADPH的生成,红细胞极易受氧化性损伤失去变形能力,在血流冲击和毛细血管的挤压作用下被破坏,发生急性溶血进而引起高胆红素血症。G-6-PD基因定位于X染色体长臂2区8带(Xq28),由13个外显子和12个内含子组成,全长约18 kb,编码的G-6-PD由515个氨基酸组成。G-6-PD缺乏的遗传方式为X染色体不完全显性遗传。男性患者只有一条X染色体,为半合子,酶活性常显著缺乏。女性两条X染色体上一般只有一条有G-6-PD基因缺陷,为杂合子,其酶活性可正常至显著缺乏。根据遗传规律,该病男性患者常多于女性患者。BAHR等[1]曾报道了一个来自欧洲血统的北美家庭家族性G-6-PD缺乏,包括64名家族成员、涉及7代人,其中就有35名男性患有严重G-6-PD 缺乏症(c.637G>T)。

G-6-PD缺乏是人类最常见的酶缺乏疾病之一,在世界范围内广泛存在,全球约5亿人受累,但患病率差异很大,在部分非洲地区的患病率>20%,在亚洲地区如中国、印度等的患病率为10%～15%,在缅甸的患病率则>20%,在美洲地区如美国、巴西等的患病率为5%～10%[2]。迄今为止,约200种G-6-PD基因突变被报道,G-6-PD基因多态性存在地域、种族差异。据国外研究报道,非洲人G-6-PD基因突变以p.Asn126Asp(G-6-PD A+)、p.Val68Met (G-6-PD Asahi)和p.Ile48Thr(G-6-PD Aures)常见,欧洲人则以p.Ala335Thr(G-6-PD Chatham)为主[3]。阿拉伯地区以p.Tyr437Tyr常见,而且p.Asp135Thr、p.Ser179Asn、p.Arg246Leu、p.Glu307Pro突变仅在阿拉伯人群中被报道[4]。BOONYAWAT等[5]报道在泰国G-6-PD缺乏的儿童中,最常见的突变为c.871G>A,其次为c.1376G>T、c.1388G>A、c.487G>A。G-6-PD基因不同位点突变导致G-6-PD不同程度失活,出现高胆红素血症,甚至出现核黄疸。2015年,LIU等[6]纳入了研究对象来自以色列、美国、印度及中国台湾地区的5篇原始文献进行荟萃分析,发现G-6-PD缺乏的新生儿高胆红素血症和光疗风险分别是G-6-PD正常新生儿的3.92倍和3.01倍,但未进行突变亚群分析。然而,WISNUMUTI等[7]报道印度尼西亚Deutromalay人群新生儿最常见的G-6-PD基因突变是c.871G>A,其次是c.1376G>T和p.Leu128Pro,但是病例组(1.72%)与对照组(1.74%)G-6-PD缺乏症的患病率相似,G-6-PD基因多态性与印度尼西亚Deutromalay人群新生儿高胆红素血症无明显关系。造成以上不同结论的原因多考虑是纳入的研究对象存在明显种族差异。此外,G-6-PD缺乏的婴儿更容易发生核黄疸。CUNINGHAM等[8]报道美国发生核黄疸的婴儿中有20%为G-6-PD缺乏,并且发生核黄疸后,G-6-PD缺乏的婴儿病死率约15%,而G-6-PD正常婴儿仅为1%。

我国G-6-PD缺乏的总体患病率约2.1%,基因突变以c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G最常见,不同地区患病率差异较大,北方地区低于南方地区[9]。LIU等[10]对中国2013-2017年共6 919 647例新生儿进行G-6-PD缺乏筛查,发现最常见的3个突变与HE等[9]报道的一致,并首次报道了4个变异位点:c.152C>T、c.290A>T、c.697G>C和c.1285A>G。G-6-PD缺乏症主要发生在华南地区,其基因多态性因地区和种族而存在差异,如:c.487G> A在山东和山西很普遍,但在广东、广西和浙江却很少;c.592C>T及c.1360C>T仅在广东、广西、山东和浙江等沿海地区的新生儿中发现。TONG等[11]对中国东南部地区1 565例高胆红素血症婴儿进行G-6-PD基因检测,发现439例(28.1%)存在G-6-PD突变。除最常见的3种突变外,该研究还检测到一个新的错义突变——c.1118 T>C,位于G-6-PD基因外显子9,这种错义突变使G-6-PD活性明显降低,出现严重高胆红素血症。

总而言之,G-6-PD缺乏在世界各国普遍常见,部分G-6-PD基因突变可引起严重高胆红素血症,造成核黄疸,甚至死亡。因此,对新生儿进行G-6-PD缺乏筛查非常必要,如若条件允许,建议将G-6-PD缺乏筛查纳入常规产前检查,对于父母存在G-6-PD缺乏或突变携带的患儿能够尽早诊断,及时治疗。

2 UGT1A1

UGT1A1现已被证实是人体内唯一能降低血清胆红素的酶,其编码基因位于2号染色体长臂37区8带(2q37),是由第1外显子和4个共同外显子(第2～5)组成的复合体,基因全长218 kb,mRNA长2.36 kb。UGT1A1基因多态性主要发生在编码区外显子、启动子,也可发生在远端加强序列、内含子及剪接位点。UGT1A1基因不同位点突变将导致UGT1A1活性不同程度降低,表现为Gilbert综合征(GS)、Crigler-Najjar综合征Ⅰ型及Ⅱ型(CNS-Ⅰ/Ⅱ)。胆红素不仅具有神经毒性,还可加重UGT1A1基因缺陷者肝功能损害。LIU等[12]曾报道在UGT1A1基因敲除的小鼠体内UCB增加可以刺激kuffer细胞释放炎症因子,进而激活肝脏星状细胞,在胆红素的刺激下,肝脏中的核因子(NF)-κB抑制剂α(IκB-α)、NF-κB抑制物激酶-β(IKK-β)和p65被过度磷酸化,导致NF-κB活化进而诱导肝细胞DNA损伤。此外,NF-κB的激活还可抑制UGT1A1的表达,从而加重高胆红素血症,如此形成了一个恶性循环。因此,临床医生在诊治高胆红素血症合并肝功能损害的患者时,若其存在UGT1A1基因缺陷,应格外重视。

目前UGT1A1基因突变已发现约163种,多为启动子及编码区外显子突变。启动子多态性以TATA盒插入突变最常见,其序列的长度与高胆红素血症程度呈负相关。UGT1A1基因可以精确调节转录起始的DNA序列,而启动子TATA盒突变会导致转录起始的频率和准确性异常,即使可以产生有正常结构的酶分子,但其表达减少会降低酶的活性,进而影响胆红素代谢。TATA盒突变是GS的遗传基础,纯合A(TA)6TAA为野生型,其余为突变型,以A(TA)7TAA突变最常见。研究发现,A(TA)7TAA在非洲裔美国人中突变率较高,约为44.6%,在高加索人群中突变率约38.8%,在俄罗斯人中突变率约为38.5%,在越南人中突变率约为6.0%,而在中国人中突变率相对较低,约为1.0%[13-15]。有研究表明复合杂合A(TA)7TAA和c.211G>A,或单一纯合A(TA)7TAA是我国汉族人群GS的主要基因型,并且显著增加患高胆红素血症的风险[16]。但在巴拿马地区,A(TA)7TAA多态性与新生儿高胆红素血症之间无明显关系[17],这可能与环境因素如日照、饮食有关。LI等[18]的一项荟萃分析认为A(TA)7TAA多态性与新生儿高胆红素血症无关,但纳入的原始研究较少(仅4篇),未来仍需要更多高质量、大样本量的研究来证实。TATA盒突变除A(TA)7TAA外,也有A(TA)8TAA、A(TA)5TAA的报道。DAPR等[19]应用Taqman PCR技术对53例GS患者UGT1A1(TA)n多态性进行基因分型,发现39.6%是野生型,24.5%为A(TA)7TAA纯合突变,30.2%为A(TA)7TAA杂合突变,A(TA)7TAA和A(TA)8TAA复合杂合突变、A(TA)5TAA杂合突变各占1.9%。UGT1A1基因编码区以第1外显子c.211G>A错义突变最常见,尤其是c.211G>A纯合突变使UGT1A1活性明显降低,表现为GS或CNS-Ⅱ。CHEN等[20]使用慢病毒载体和COS-7细胞建立体外UGT1A1野生型和c.211G>A纯合及杂合突变的细胞模型,发现c.211G>A纯合子及杂合子UGT1A1活性分别为野生型的22.0%和71.0%,纯合酶活性明显低于杂合酶,原因可能是c.211G>A突变影响了蛋白质的空间构象,降低了酶与底物的结合。c.211G>A突变是新生儿高胆红素血症的危险因素,主要见于中国、日本、韩国等亚洲黄种人,在欧洲、美洲等白种人较少见[15,21]。除c.211G>A外,外显子c.3279 T>G也有报道。2020年,LI等[22]纳入了7项病例对照研究进行荟萃分析,发现c.3279 T>G是新生儿高胆红素血症的易感因素,但是其纳入的研究对象包括亚洲人群、非洲人及高加索人,其人种、环境、生活习惯的异质性可能影响荟萃分析的结果。近年来,随着分子生物学的发展,基因检测技术的进步,越来越多的突变位点被报道。2022年,GU等[13]报道在中国人群中新发现了7个变异位点,分别是p.Ala61Gly、p.Leu166Alafs*16、p.Ser306Phe、p.Glu424*、p.R341Q、p.R240K、p.Y67F,其中前4个变异可能是致病变异,后3个变异意义不明。这可能是因为UGT1A1基因与多种疾病的发生、发展有关,除高胆红素血症外,UGT1A1基因多态性与乳腺癌、前列腺癌、直肠癌等癌症以及伊立替康导致化疗相关性腹泻、中性粒细胞减少均有关系。对于意义不明的突变是否与临床表型相关,未来可以利用基因重组技术进行基因敲除,从而进行功能验证。

3 SLCO1B1

SLCO1B1基因编码的OATP2在肝细胞摄取胆红素的过程中起重要作用,SLCO1B1基因突变将影响OATP2转运功能,进而引起高胆红素血症。SLCO1B1基因位于12号染色体短臂1区2带(12p12),全长108.59 kb,由15个外显子和14 个内含子组成。人类OATP2的cDNA包含2 073个碱基对,编码691个氨基酸。研究发现,与在人脑、肾脏、肝脏和睾丸中均高度表达的人OATP1相比,OATP2的强信号仅在肝脏中检测到,是肝细胞基底膜外侧将有机阴离子、未结合胆红素等转运至细胞内的一种极其重要的转运蛋白。迄今为止,已发现的SLCO1B1基因突变已超过100余种,研究最多的是c.388 G>A及c.521 T>C。PASANEN等[23]研究了来自非洲、中东、亚洲、欧洲、大洋洲和美洲的52个人群SLCO1B1等位基因分布,发现c.521T>C频率在人群之间显著不同,在美国人群中为24.0%,在欧洲人群中18.0%,在撒哈拉以南非洲人群中为1.9%,在大洋洲人群中为0.0%,并且经种群之间相比发现,SLCO1B1基因在种群内部更具多样性。LEE等[24]研究发现c.521T>C在欧美人群中突变频率较高,约14%,在非裔美国人中则为2%,与PASANEN等[23]结果一致;相反,c.388A>G则主要见于非裔美国人,约74%,欧美人则为30%。BOO等[25]研究认为SLCO1B1变异体在马来西亚新生儿中普遍存在(49.3%),其中,c.388 G>A占26.3%,c.512 T>C占23.0%,而且c.388 G>A是新生儿高胆红素血症的风险因素。AMANDITO等[26]报道c.512 T>C在印度尼西亚高胆红素血症新生儿中很常见,但其多态性与胆红素水平无关。在国内,BAI等[27]、LI等[28]均认为c.521T>C是中国人群高胆红素血症的遗传危险因素,但张钰恒等[29]的研究不支持此观点。我国幅员辽阔、民族众多,地域、民族异质性可能是造成以上不同观点的主要原因;其次是研究样本数量有限,代表性欠佳,未来仍需扩大样本研究,进一步对民族亚群进行分析。

4 HO-1

血红素氧合酶(HO)的编码基因位于染色体22q12上,由5个外显子和4个内含子组成,是细胞内唯一能分解血红素的管家酶,相对分子质量约为33×103,是一种单体蛋白,可将血红素降解为等摩尔量的一氧化碳、游离铁和胆绿素。HO以3种活性异构体(HO-1、HO-2和HO-3)存在。HO-1,也称为热休克蛋白 32(Hsp32),是一种诱导型亚型,其表达可被不同的应激条件上调,并被多种刺激激活;HO-2和HO-3为组成型亚型,在大多数人体组织中以基础水平表达,但在神经元、脾脏和肝脏中的水平较高。HO-1活性在很大程度上取决于转录水平。然而,HO-1启动子的表达受肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、神经生长因子、白细胞介素、γ-干扰素及其底物等多种刺激因子调节。因此,这些刺激因子水平可间接影响HO-1活性,最终引起一系列疾病。

目前关于HO-1基因多态性与高胆红素血症的研究主要集中在启动子区域(GT)n重复多态性,而且短(GT)n等位基因可能是高胆红素血症的遗传危险因素[30]。TIWARI等[31]报道印度新生儿(GT)n重复长度在15～40个,短(GT)n重复(≤20个)是新生儿高胆红素血症的独立危险因素。KATAYAMA等[32]报道日本新生儿(GT)n重复长度在16～41个,排除UGT1A1基因211G>A多态性携带者后,短(GT)n等位基因(<22个)的携带者新生儿高胆红素血症的发生率更高。以上两项研究表明不同地区(GT)n的重复长度范围差异不大,短(GT)n增加了患高胆红素血症的风险。但是,在一项针对非裔美国婴儿的(GT)n多态性研究中,将等位基因长度分为短(S,<25个)、中 (M,25～33个)、长(L,>33个),其中有12.2% 的等位基因是S,但是至少有1个L等位基因的婴儿与至少有1个S等位基因的婴儿之间的总胆红素血症风险百分位数差异无统计学意义[(48.6±34.0)%vs.(44.9±31.6)%,P=0.51][33]。这些研究结果不一致可能与地域、种族差异有关,前两项研究以亚洲人群为研究对象,后一项研究则以非裔人群为研究对象。但也有可能是因为胆红素水平易受到其他遗传因素或环境因素的影响。总体而言,目前关于HO-1基因多态性与高胆红素血症的相关性研究较少,结论不一,对于(GT)n重复长短定义也不同,未来仍需大量样本进行研究,以定义出短(GT)n数,并对多项研究荟萃分析短(GT)n是否为高胆红素血症的危险因素。

5 BLVRA

BLVR有2种同工酶,即BLVRA和BLVRB。BLVRA水平在妊娠20周时增加,而BLVRB在妊娠14～15周可以被检出。BLVRA的mRNA在脑、肺和胰腺中水平较高,在肝脏和胎盘中水平较低。BLVRA将胆绿素Ⅸα还原为胆红素Ⅸα,即未结合胆红素,是成人胆红素的主要形式。BLVRB存在于成人的所有组织中,其功能作用尚未完全阐明。HO在β-meso位置裂解胎儿血红素,产生胆绿素Ⅸβ,再由BLVRB还原为胆红素Ⅸβ,胆红素Ⅸβ的溶解度较高,可以直接排泄。因此,BLVR基因多态性与高胆红素血症的研究主要为BLVRA多态性与高胆红素血症的研究。编码人胆绿素-Ⅸα还原酶的cDNA核苷酸长度约1 146 bp,编码296个氨基酸。BLVRA主要以单体形式存在,是血红蛋白氧化酶-胆红素抗氧化系统的重要成员之一,具有苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸蛋白激酶的活性,可以激活TF-2和HO-1的转录因子,参与细胞内信号传导。BLVRA基因突变导致其结构改变,影响其功能。LI等[28]报道rs699512基因座是BLVRA基因唯一常见的非同义单核苷酸多态性,其错义突变使极性苏氨酸(Thr)变为非极性丙氨酸(Ala),使BLVRA活性增加,最终引起胆红素升高,是中国汉族新生儿人群中新生儿高胆红素血症的易感基因。周进福等[34]以福建地区新生儿高胆红素血症患儿为研究对象,发现rs699512位点A等位基因及rs1637530位点C等位基因是新生儿高胆红素血症的易感基因,但YANG等[35]研究认为rs699512位点多态性和新生儿高胆红素血症无明显相关。目前为止,BLVRA基因多态性与高胆红素血症相关性研究较少,其具体发病机制尚未阐明,未来有待进一步研究。

6 小结与展望

综上所述,G-6-PD、UGT1A1、SLCO1B1、HO-1、BLVRA基因多态性均存在地域、种族差异,不同突变位点在不同人群中基因频率不同,而且G-6-PD、UGT1A1、SLCO1B1基因突变具有积累效应,携带风险因素的数量越多,发生高胆红素血症及其并发症的风险就越大。但截至目前,大多数研究局限于基因多态性与高胆红素血症的相关性,对其治疗及预后研究甚少,而且由于研究样本数量有限,部分研究结果相悖。随着科技的发展及基因检测技术的进步,人类将迎来基因时代,未来仍需进行大样本基因多态性与高胆红素血症的相关研究,对于存在基因突变的高胆红素血症患者,以期治疗上能从基因方面取得突破。