1例补体介导的溶血性贫血鉴定分析*

邹 昕,范小杰

1.江苏省常州市中心血站输血研究室,江苏常州 213004;2.江苏省常州市第一人民医院检验科,江苏常州 213004

自身免疫性溶血性贫血(AIHA)是指人类免疫功能紊乱产生抗自身红细胞的抗体,与红细胞表面的抗原相结合或激活补体使红细胞寿命缩短的一种获得性疾病。根据自身抗体不同,AIHA的自身抗体可分为温抗体、冷抗体、温冷抗体混合3种类型[1],其中温冷抗体混合型比较少见。补体是先天免疫的主要参与者之一。抗原抗体复合物可以通过经典途径激活补体形成膜攻击复合物导致红细胞直接裂解或被肝脾捕获参与溶血。现对1例补体介导的温冷自身抗体引起的AIHA鉴定过程报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 患者,女,72岁,2019年1月因贫血而输注辐照洗涤红细胞4 U,2022年2月5日因反复黄疸伴茶色尿6年余,重度贫血入院,血红蛋白 56 g/L,网织红细胞百分率1.8%,超敏C反应蛋白97.85 mg/L,总胆红素23.5 μmol/L,直接胆红素9.4 μmol/L,乳酸脱氢酶439 U/L,血糖21.7 mol/L,此次交叉配血中发现ABO血型鉴定困难,直接抗球蛋白试验(DAT)阳性,遂送常州市中心血站输血研究室进行交叉配血。

1.2仪器与试剂 抗-A/B单克隆抗体(上海血液生物医药有限责任公司,批号:20191119);抗-D(IgM)单克隆抗体(上海血液生物医药有限责任公司,批号:20200301101);ABO血型反定型红细胞(北京金豪制药股份有限公司,批号:20200701016);抗体筛选细胞(德国CE公司,批号:702101);谱细胞(德国CE公司,批号:732103; 荷兰Sanquin公司,批号:8000453184);抗球蛋白凝胶卡(上海润普生物技术有限公司,批号:10210801;长春博迅生物技术有限责任公司,批号:202100307/20211103);酸放散试剂盒(上海申型医学科技有限公司,批号:20212101); 2-巯基乙醇 (2-Me,上海血液生物医药有限责任公司,批号:20217701)。贝克曼高速离心机,久保田KA-2200血清学专用离心机;37 ℃/56 ℃恒温水浴箱;配套卡式离心机。

1.3方法

1.3.1血清学检测 采用试管法和微柱凝胶法检测患者 ABO及 RhD血型,以及进行DAT、间接抗球蛋白试验(IAT);在不同的条件下进行不规则抗体筛查(血清在56 ℃灭活、加入新鲜补体试验,2-Me处理);应用谱细胞进行不规则抗体鉴定;采用等比稀释法进行抗体效价检测。所有试验严格按照第18版AABB[2]和《输血技术操作规程:输血科部分》[3]操作规程进行操作。

1.3.2吸收放散试验 患者自体细胞45 ℃放散至DAT阴性,再做自身吸收放散试验。放散试验按照酸放散试剂说明书进行操作。

1.3.3温度依赖性补体结合试验 采集ABO同型献血者不抗凝和EDTA抗凝血标本,以获得新鲜血清和红细胞。取洗涤过的红细胞20 μL(用生理盐水配成50%的细胞悬液)在37 ℃和22 ℃恒温下孵育15 min,将患者和供体的血清或血浆预热至相同温度,平衡温度后,在预热的红细胞中加入100 μL患者血清和100 μL供体血清(含新鲜补体),相应温度下孵育1、2、3、4、5、6、7、8 h观察溶血情况[4]。

2 结 果

2.1血型血清学检测 ABO血型血清学鉴定结果:盐水介质立即离心(IS),正定型A抗原与抗-A反应可达4+,B抗原与抗-B反应达1+,抗-D反应4+;反定型IS法均有凝集。温盐水洗涤患者红细胞6次后继续试验,ABO正定型为A型;反定型在37 ℃孵育1 min后鉴定为A型。正反定型一致。

2.2DAT结果 直接试管法DAT试验结果多抗和抗-C3d均为4+,抗-IgG为弱凝集。同时抗人球蛋白凝胶卡试验结果多抗为4+,抗-IgG为2+。AB型血浆对照阴性。

2.3血清和血浆不同条件下抗体筛选结果 血清和血浆抗筛结果不一致,37 ℃恒温孵育15 min 后凝集消失,2-Me处理IgM冷抗体后抗筛结果仍为阳性。自身对照始终为阳性。具体结果如表1。

血清在56 ℃孵育30 min灭活后做抗筛试验,见表2,盐水中抗筛结果全阳性,而IAT结果全为阴性。加入新鲜血清后,IAT结果又复为阳性。抗体鉴定结果与抗筛结果一致,没有特异性。

表2 血清补体试验结果(试管法)

2.4抗体效价及性质测定 原始血清用盐水法在4 ℃时效价为256;在22 ℃时效价为16。2-Me处理血清用IAT法在37 ℃时效价为4。

2.5自身吸收和放散试验 取45 ℃放散成DAT为阴性的患者红细胞0.5 mL与自身血清在4 ℃、37 ℃吸收1 h,吸收后的血清抗筛结果为阴性,表明无其他特异性同种抗体。取未处理的0.5 mL患者压积红细胞进行酸放散试验,在酸放散液中进行抗体筛选,结果IS和IAT试验全阴性。

2.6温度依赖性补体结合试验 温度依赖性补体结合试验结果37 ℃组在试验开始1 h出现溶血现象,而22 ℃组在4 h出现溶血,两组随着时间的延长溶血程度均有增加。

3 讨 论

临床上AIHA患者体内,自身抗体和同种抗体往往同时存在且呈泛反应现象,此类患者大多数DAT呈阳性[5]。鉴别红细胞上的抗体非常重要,该类患者若进行不相容输血后,其自身抗体会对供者红细胞产生致敏反应,且在补体作用下极易发生溶血现象。

结合本例患者病史、临床表现和实验室检查依据,包括总胆红素、直接胆红素、乳酸脱氢酶等,均证明红细胞有溶血现象。本案例DAT试验证明以抗-C3d阳性为主。高效价的冷抗体致使红细胞自凝,在温盐水洗涤以及37 ℃孵育后检出患者血型为A型、RhD阳性。该患者原始血清和血浆抗筛结果截然相反,这是由于EDTA抗凝剂能够结合Ca2+离子,抑制了补体的激活途径,此抗体可能是具有广谱特异性的自身抗体[6]。在实验室检测时把血清在56 ℃灭活30 min,IAT结果为阴性,而增加新鲜血清即补体,IAT结果又为阳性,这进一步证明补体介导抗体引起溶血[7]。在原始血清中的IAT(抗-IgG+抗-C3d、抗-IgG)均为阳性,与试管法结果一致。进一步尝试证明补体介导的是冷抗体或温抗体还是温冷混合自身抗体引起的溶血。用2-Me破坏IgM抗体后再进行抗筛,结果凝集强度下降,说明补体介导了温冷混合自身抗体引起溶血。该抗体在4 ℃时效价高达256,而37 ℃时(IAT法)效价为4,证明本例患者主要以冷抗体为主[8]。酸放散抗筛结果全为阴性,原因可能是IgM/IgG抗体量少,低于检测阈值而未检出或没有,只有补体致敏红细胞,今后可以考虑其他放散方法,如56 ℃热放散等方法[9]。用自身抗体进行冷吸收后发现吸收后的血清抗体筛查阴性,进一步排除有同种抗体存在,且该自身抗体既有冷抗体的特性又有温抗体的特性。AIHA患者如何输注血液是关键。温度依赖性补体结合试验原理是在体外将患者血浆中的溶血相关抗体置于37 ℃和22 ℃充分致敏供者红细胞,加入补体使其吸附于抗原抗体上,通过补体的激活作用在红细胞膜上形成一个通道,使红细胞内的血红蛋白溢出,发生溶血现象[10-13]。

本例患者温度依赖性补体结合试验在37 ℃和22 ℃配血均有溶血现象,说明患者体内存在能与输入红细胞特异性结合的抗体,并且有补体特异性,存在输入后产生血管内急性溶血性输血反应的因素,后来跟医院协商患者暂时不输血。此类患者只在血清中检出抗体,而临床上相当一部分医院只用EDTA抗凝管的血浆进行抗体筛查和交叉配血,容易漏检,输血风险很大。如必须输血的话尽量选择常规配血加溶血试验,降低溶血性输血反应及其他不良反应的发生。