植物乳植杆菌发酵复合果汁饮料香气成分变化过程的分析*

陈驰，吴伯文，杨晓丽，韩金志，周红艳,*

（1.福建农业职业技术学院，福建 福州 350119；2福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350108）

0 引言

乳酸菌是一类在自然界分布广泛的益生菌[1]，并作为重要的发酵菌株应用于发酵食品工业。在食品发酵过程之中，乳酸菌可有效改善食品特征风味，并通过代谢产生多种有机酸、寡肽、细菌素、γ-氨基丁酸等生物活性物质[2]，赋予发酵食品改善肠道微生态、提高机体免疫力等生理功效[3-7]；此外，可有效延长产品保质期[8]。《食品安全国家标准 果蔬汁类及其饮料》将发酵果蔬汁饮料定义为把果蔬或者果蔬汁与水作为原料，添加或者不添加其他辅料与食品添加剂制成的食品[9]。乳酸菌在发酵过程中以果蔬汁中的营养物质作为发酵基质，经过分解及合成代谢过程改变底物的物质组成并可赋予产品独特的风味[10]。

近年来，固相微萃取提取技术与气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）联用被广泛应用于食品中香气成分组成分析[11]；同时，在此分析技术上，结合内标法可进一步对靶向挥发性化合物进行定量分析[12]。该技术可为食品中特征挥发性香气物质组成及其在生产加工过程中的变化规律分析提供有效途径。

经乳酸菌发酵可进一步提升复合果汁饮料的风味与营养品质。本文以芒果、哈密瓜复合果汁为基质，选择食品源植物乳植杆菌为发酵剂，探讨在不同发酵阶段复合果汁的挥发性气味物质与感官品质的变化过程。该研究结果可为乳酸菌发酵果汁饮料的产业化开发与产品质量控制提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 材料与试剂

哈密瓜、芒果、纯净水 市售；2-辛醇，分析纯，购买于美国Sigma-Aldrich公司；植物乳植杆菌CGMCC 20601来源于福州大学生物科学与工程学院。

1.2 仪器设备

恒温生化培养箱，SPX-150BIII，黄骅菲斯福实验仪器有限公司；紫外可见分光光度计，UV-1100型，上海美普达仪器有限公司；分析电子天平，HZKFA2105，美国康州HZ电子科技有限公司；理化分析型超纯水机，WP-UP-LH-20，四川沃特尔水处理设备有限公司；高速冷冻离心机，Fresco 17，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；数显pH计，MP511，上海三信仪表厂；立式高压灭菌锅，LDZF-50L-Ⅲ，上海申安医疗器械厂；气相-色谱质谱联用仪（GCMS），5977A，美国安捷伦科技有限公司；电磁搅拌器，OMS-181E，上海欧河机械设备有限公司；SPME手动进样柄，57330-U，美国Supelco公司。固相微萃取萃取头，PDMS 30um，美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 复合果汁的制备

将芒果与哈密瓜清洗去皮并切块，80 ℃漂烫2 min，冷却榨汁后用纱布过滤，自然澄清，2种水果与纯净水以1∶1∶3的比例进行调配，装罐密封后115 ℃条件下高压灭菌20 min，随之冷却降至室温。

1.3.2 菌株接种与恒温培养[13]

将上述灭菌后复合果汁按体积比0.5%接入植物乳植杆菌生理盐水菌悬液（OD600为0.5～0.6），37 ℃条件下恒温静置发酵，设置3个平行。同时，于0、6、12、24、36、48 h分别取样置于离心管中并储存至-20 ℃冰箱待用。

1.3.3 pH值的测定

取约7 mL样品于10 mL离心管，使用数显pH计测定发酵复合果汁样品的pH值，平行取2组，做好标记置于-20 ℃冰箱冷冻保藏，待后续检测用。取少许发酵好的果汁于烧杯中，以酚酞为指示剂，采用0.1 mol/L的NaOH溶液进行酸碱滴定，计算出酸度。

1.3.4 感官评定

复合果汁经乳植杆菌在不同发酵阶段取样，并依据表1中描述的感官评定标准开展感官品质评定。

表1 耐介质处理前后拉断力的试验结果

1.3.5 顶空固相微萃取

将不同发酵时间取得的果汁样品依据李瑞丽等描述的方法[14]进行顶空固相微萃取操作。首先，取12 mL顶空萃取瓶，取5 mL样品置于其中，依次加入10 μL浓度为10 mg/mL 2-辛醇（内标）和1 g NaCl，然后置于40 ℃水浴磁力搅拌器上，600 r/min条件下搅拌、温育20 min，将固相微萃取针插入顶空萃瓶，压出萃取纤维，并将其固定在距离液面0.5～1.0 cm处，持续温育、吸附、萃取30 min后收回萃取纤维，拔出萃取针并插入气相色谱质谱联用仪中进样分析。

1.3.6 气相色谱质谱联用（GC-MS）分析[15]

对GC-MS分析条件进行设置。首先，将进样口温度设定为250 ℃，并选择DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）进行分析；同时，将柱温箱起始温度设置为40 ℃，保留8 min，然后以4 ℃/min升温至150 ℃，随之以20 ℃/min升温至250 ℃，并保持恒定温度5 min。选择99.999%高纯度氦气作为载气，并将流速设定为1 mL/min；同时，将离子源温度设置为230 ℃，电离方式选择EI，并设置电离能量：70 eV，接口温度：250 ℃，四级杆温度：150 ℃；此外，选择在SCAN模式下进行扫描开展定性分析；同时，离子碎片的扫描范围为 30～500 m/z，溶剂延迟时间为2.5 min。

1.3.7 挥发性成分的定量分析

选择匹配度≥85，并采用内标法进行定量分析，根据待测样品和内标物的峰面积，按照公式⑴计算待测组分在样品中的含量。

1.3.8 数据处理分析

使用运用Origin 8.5软件进行绘图，包括pH值变化分析、热图相关制作等；使用SIMCA 14.2软件进行聚类分析。所分析数据为3次测定的平均值。

2 结果与分析

2.1 不同发酵时间复合果汁pH值变化

乳植杆菌代谢产酸是表明乳植杆菌可适应其生长环境并进行正常繁殖代谢活动的重要指标。由图1可见，在发酵过程中，pH值呈现逐步下降趋势，并在发酵36～48 h降至3.5并维持在稳定状态。在此过程中，植物乳植杆菌可利用果汁中的可发酵糖类作为发酵底物经代谢后生成乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸等短链脂肪酸，大量有机酸积累导致体系pH值下降。

图1 复合果汁饮料pH值在发酵过程的变化

2.2 感官评定

香气、滋味、色泽等感官属性是评价食品是否具有产业化前景的重要指标。由图2可见，经植物乳植杆菌发酵，在不同时间段复合果汁的感官评分逐步提升并在发酵36 h时，评分达到最高值95，随着发酵时间的延长至48 h感官评分略有下降。

图2 感官评定结果

2.3 不同发酵时间果汁中挥发性物质数量变化

由表2所示，随着发酵过程的进展，挥发性物质数量呈现逐步增加趋势，且发酵36 h后由发酵果汁中鉴定出89种挥发性气味物质，持续发酵至48 h，挥发性气味物质则下降至79种。乳植杆菌发酵复合果汁中主要的风味物质来自发酵过程中产生的醇、醛、酸、酯、酮等香味物质。其中，在发酵24 h之前，这些风味物质数量及种类都相对较少，复合果汁的香味没有太明显的变化；发酵36 h和48 h时检测到的物质较为丰富，其中以酮类物质为主，如2-壬酮、甲基己基壬酮等。这类物质一般具有水果、药草、花、柏木等的味道。酚类、醛类、酸类、酯类及酮类均在发酵36 h后达到最高值，分别为15种、12种、8种、16种、10种。

表2 果汁中主要的挥发性物质数量

2.4 不同发酵阶段果汁中挥发性气味物质组成的热图分析

复合果汁经乳植杆菌发酵，果汁中的物质组成处于动态变化过程。其中，在不同发酵阶段其中的挥发性气味物质组成亦存在差异。如图3所示，发酵0 h复合果汁中的挥发性气味物质以乙酸卞酯、3,4-二甲基苯甲醛、苄醇、对甲基苯乙酮、壬醛、2,4-二叔丁基苯酚和苯乙醇等为主；发酵6 h则以2-甲基丁基乙酸酯、1-己醇、3-蒈烯、二甲基三硫为主；发酵12 h，果汁中出现肉桂醛和反式肉桂醛；发酵24 h时则产生较多乙酸异丁酯；发酵36 h时的主要挥发性气味物质包括2-壬酮、1-壬醇、乙酸、乙酸己酯、反式肉桂醛、癸醛、2-十三烷酮、1-石竹烯、3-羟基-2-丁酮等；发酵48 h时，2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-羧醛、2-壬酮、甲基己基壬酮、葵醛、1-壬醇、2-庚酮等物质成为果汁中的重要挥发性气味物质。

图3 发酵复合果汁热图

2.5 发酵果汁中挥发性香气物质主成分分析

将不同发酵阶段复合果汁中的挥发性香气物质进行多元数据分析。聚类分析结果如图4所示，发酵前期（0 h）的特征挥发性气味物质较少，发酵6 h主要是2-甲基丁基乙酸酯、1-己醇、蒎烯；发酵12 h主要是肉桂醛和反式肉桂醛；24 h主要是3-羟基-2-丁酮；36 h和48 h的特征化合物明显有变多，主要包括β-紫罗酮、1-石竹烯、乙酸己酯、甲基壬基甲酮、2-十三烷酮、2-壬酮、苯甲醛、1-辛醇等。

图4 发酵复合果汁样本主成分分析

3 结语

近些年，乳酸菌发酵可赋予食品独特的风味与显著的益生功能而备受关注。本研究主要探讨并详细阐明了植物乳植杆菌发酵复合果汁在不同发酵阶段果汁中主要挥发性气味物质组成及其变化过程；并同时对不同发酵阶段果汁的感官品质进行分析，确定了最佳发酵时间。本研究可为乳酸菌发酵果汁饮料的产业化应用与产品质量控制提供理论参考。