黑豆不同发芽期多酚、黄酮及抗氧化活性分析

李楠，孟航婷，孙元琳，王芮东

1. 运城学院生命科学系（运城 044000）；2. 运城学院理科实验中心（运城 044000）

黑豆（Glycine maxVar）是豆科植物的黑色种子，含有大量的营养物质和生物活性物质，如蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、微量元素、酚类物质、异黄酮、花青素等，可以降低血脂，促进胆固醇的代谢，具有抗氧化、降血压、抗肿瘤等作用[1-2]。但黑豆中也含有蛋白酶抑制剂、植酸、脂肪氧化酶等抗营养成分，影响黑豆在体内的生物利用度，因此，如何消除这些抗营养成分，并最大限度保留黑豆中原有的营养素，成为亟待解决的问题。有研究表明，发芽能够激活种子的内源酶和代谢通路，豆类等经过发芽后，其化学组分会发生改变，抗营养因子减少，某些活性成分增加，食品的感官性能和风味得以改善，实用价值及保健功能提高[3-5]。Okumura等[6]的研究发现蚕豆芽中的酚类化合物为山奈酚，蚕豆发芽后其抗氧化性高于未发芽蚕豆和其他豆类。罗旭等[7]通过相关性分析发现，大豆萌芽过程中活性物质增加，特别是总多酚和总黄酮含量越高，其抗氧化能力越强。杜高发等[8]发现鹰嘴豆在发芽过程中蛋白质含量下降而氨基酸含量升高，不溶性膳食纤维含量下降而可溶性膳食纤维含量升高。鲍会梅[9]发现黑豆发芽过程中叶绿素、维生素C、异黄酮、多酚等成分增加，发芽5～6 d营养价值最高。所以，豆类发芽并开发芽苗菜产品受到密切关注。

黑豆在水培发芽过程中，多酚、黄酮等活性物质含量及抗氧化活性如何变化尚不清楚，因此以黑豆为原料，于25 ℃水培发芽，每隔12 h采样，测定黑豆不同发芽期多酚、黄酮、花青素含量的变化和对DPPH·、ABTS+·和·OH的清除能力，并分析活性物质与抗氧化活性之间的相关性，以期为黑豆资源的多元化利用、黑豆芽苗菜的选育及黑豆芽苗菜功能性产品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑豆（产自山东省济宁市）。没食子酸、福林酚、芦丁、DPPH、ABTS（合肥博美生物科技有限公司）；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸、过硫酸钾、水杨酸、硫酸亚铁、30%过氧化氢等（均为市售，分析纯）。

1.2 主要仪器与设备

UV 5500PC紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；SPX-100B-Z生化培养箱（上海博迅实业有限公司）；FA1604电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；LK-800A摇摆式中药粉碎机（上海隆拓仪器设备有限公司）；TDL6M离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PHS-3C数显酸度计（杭州奥立龙仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 黑豆发芽条件

选取颗粒饱满的黑豆，用蒸馏水冲洗以去除表面灰尘，用蒸馏水浸泡8 h，将黑豆单层均匀平铺于发芽器网格盘中，底盘中加入适量蒸馏水，于25 ℃生化培养箱中发芽，每6～8 h喷1次水，每隔12 h收集发芽的黑豆[10]。

1.3.2 样品前处理

将收集的样品置于50 ℃电热鼓风干燥箱中烘干，直至恒重，用中药粉碎机粉碎，过0.180 mm孔径（80目）筛。将样品粉末用沸程30～60 ℃的石油醚浸泡12 h，以除去其中的油脂，脱脂后的样品粉末置于通风处，挥干溶剂，置于密封袋中，-20 ℃冰箱保存备用[11]。

称取1 g脱脂样品粉末，加入30 mL 70%乙醇，避光超声提取30 min，提取温度70 ℃，功率300 W，在3 000 r/min下离心15 min，收集上清液，重复提取2次，合并上清液并定容至100 mL得样品提取液[12]。

1.3.3 活性物质测定方法

1.3.3.1 多酚含量测定

参考王飞霞等[13]的方法并稍做修改。准确吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL的0.1 mg/mL没食子酸标准溶液，加入1 mL福林酚试剂，反应5 min，加入2 mL 15%的NaCO3，用蒸馏水定容至10 mL，避光反应60 min，于765 nm波长处测定其吸光度。得标准曲线y=0.916 9x+0.117 8，R2=0.971 1，其中x为没食子酸质量浓度（mg/mL），y为吸光度。准确吸取1 mL样品提取液，按照上述方法测定其吸光度，并将结果换算成多酚含量。

1.3.3.2 黄酮含量测定

参考南海娟等[14]的方法并稍作修改。准确吸取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0和2.4 mL的0.2 mg/mL芦丁标准溶液，加0.2 mL 5% NaNO2；6 min后，加0.2 mL 10% Al(NO3)3；6 min后，加入2 mL 4% NaOH，用60%乙醇定容至10 mL，混匀，避光反应15 min，在波长510 nm处测定吸光度。得标准曲线y=0.086 8x-0.002 1，R2=0.996 3，其中x为芦丁质量浓度（mg/mL），y为吸光度。准确吸取1 mL样品提取液，按照上述方法测定其吸光度，并将结果换算成黄酮含量。

1.3.3.3 花青素含量测定

参考汪洋等[15]的方法并稍作修改。准确称取1 g脱脂样品粉末，加入1%盐酸-乙醇混合液40 mL，于55℃水浴浸提120 min。冷却至室温后过滤，得样品溶液。采用消光系数法测定花青素含量。在波长525 nm下测定样品的吸光度，按照式（1）计算花青素含量（mg/g）。

式中：A为样品吸光度；V为定容体积，mL；M为样品质量，g；98.2为花色苷平均消光系数。

1.3.4 抗氧化活性测定方法

1.3.4.1 对DPPH·清除率的测定

参考赵巧玲等[16]的方法并稍作修改。取2.0 mL样品提取液，加入4 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，用蒸馏水定容至10 mL，避光反应30 min，在波长517 nm处测定样品组吸光度。根据式（2）求DPPH·清除率。

式中：A1为样品组吸光度；A2为样品本底吸光度；A0为以蒸馏水代替样品提取液的空白对照吸光度。

1.3.4.2 对ABTS+·清除率的测定

参考胡治远等[17]的方法并取样品提取液0.1 mL测定对ABTS+·清除率，根据式（2）计算对ABTS+·清除率。

1.3.4.3 对·OH清除率的测定

参考蔡萌等[18]的方法，根据式（2）求对·OH清除率。

2 结果与分析

2.1 多酚含量变化

由图1可知，多酚含量在前48 h变化不显著（P＜0.05），后呈平稳上升趋势，发芽至84 h时，多酚含量达到最大值，为8.3 mg/g，与发芽72 h和96 h差异显著（P＜0.05）。推测是因为黑豆发芽后，会激活苯丙烷代谢途径，相关酶活力增加，降解细胞壁周围的成分，因而酚类物质与蛋白质、多糖之间的共价键被破坏，结合酚被释放从而游离出来，使总酚含量呈上升趋势[19]。另外，多酚含量变化趋势与多酚氧化酶的含量及活性相关，发芽初期，多酚氧化酶活性较高，会氧化分解一部分多酚化合物，因而发芽前48 h多酚含量变化不显著，随着发芽时间延长，多酚氧化酶的活力逐渐下降，多酚含量也随之增加[20]。结果表明黑豆发芽后，多酚含量会显著增加。

图1 黑豆不同发芽期多酚含量的变化

2.2 黄酮含量变化

由图2可知，随着发芽时间的延长，黄酮含量呈上升趋势，从发芽12 h到发芽96 h，其含量增加3.9 mg/g，表明黑豆在发芽过程中进行黄酮的合成。有研究表明，苯丙氨酸氨解酶是黄酮类次生代谢产物形成的关键酶，在种子发芽初期，酶活力较低，随着发芽时间的延长，呼吸作用增强，酶的种类和数量增加，酶活性不断提高[9]，所以黑豆发芽过程中黄酮含量不断上升。

图2 黑豆不同发芽期黄酮含量的变化

2.3 花青素含量变化

由图3可知，花青素含量在黑豆发芽过程中不断下降。黑豆在发芽12 h时，其花青素含量最高，为3.635 mg/g，发芽96 h时其含量最低，为0.267 mg/g，下降值为3.369 mg/g。不同发芽时间花青素含量存在显著性差异（P＜0.05）。赵巧玲等[16]研究结果表明，在武乡小黑豆发芽过程中，其种皮花色苷含量逐渐降低，与试验结果相似。黑豆中花青素主要集中在黑豆表皮，是一种水溶性植物色素，浸泡黑豆时，花青素溶解在水中，含量降低，发芽过程中淋水也会造成花青素含量的损失[21]。所以随发芽时间延长，花青素含量降低。

图3 黑豆不同发芽期花青素含量的变化

2.4 抗氧化活性变化

由图4（A）可知，黑豆发芽过程中，对DPPH·清除率先略微下降后呈一直上升趋势，发芽24 h时对DPPH·清除率最弱，随着发芽时间的延长，在84 h时达到最大值，为57.18%。由图4（B）可知，其对ABTS+·清除率呈上升趋势，在96 h时达到最大值，为54.78%。由图4（C）可知，其对·OH的清除率呈现先增加后下降趋势，在72 h时清除率最大，为26.13%。

图4 黑豆不同发芽期对不同自由基清除率的变化

多酚与黄酮类化合物是植物的主要次生代谢产物，种子萌芽会激发种子内大量酶的活性，使多酚与黄酮等次级代谢产物大量生成，而多酚和黄酮是天然的抗氧化剂，具有较强的抗氧化及清除自由基的能力，所以，在黑豆发芽过程中，随着发芽时间延长，对DPPH·、ABTS+·和·OH的清除率逐渐升高。李丽等[22]研究表明，赤小豆在发芽过程中抗氧化能力明显提升，在第5天达到最高，并得出发挥抗氧化作用的主要成分为4种酚酸和7种黄酮类物质。吕俊丽等[19]在研究发芽对莜麦体外抗氧化能力的影响时，得出随着发芽时间延长，莜麦总还原能力、对DPPH·和羟基自由基的清除能力增强的结论，与试验结果相似。

2.5 相关性分析

用SPSS软件对不同发芽时间黑豆多酚、黄酮、花青素含量与其对DPPH·、ABTS+·和·OH的清除率做相关性分析，结果见表1。

表1 多酚、黄酮、花青素含量与抗氧化能力的相关系数

不同发芽时间黑豆多酚、黄酮含量与其对DPPH·、ABTS+·和·OH清除率均呈一定正相关性（P＜0.05），多酚含量和3种自由基清除率相关系数分别为0.950，0.767和0.778，黄酮含量和3种自由基清除率相关系数分别为0.830，0.959和0.761，表明多酚、黄酮含量均和3种自由基清除率显著正相关。花青素含量与上述自由基清除率呈负相关。马燕等[23]在研究发芽对小麦抗氧化能力的影响时证实，不同生长阶段的小麦总酚含量与自由基清除率呈现显著正相关，与试验结果相同。赵齐燕等[24]的研究发现紫云英苗菜的总酚、总黄酮含量与DPPH·、ABTS+·清除能力显著相关，且贡献率较大的活性物质为山奈酚、槲皮素和阿魏酸。赵天瑶等[25]发现豆类种子中酚类物质含量与抗氧化性存在正相关关系，在黑豆发芽过程中，会积累多酚及黄酮类物质，其清除自由基能力增加，所以，黑豆发芽后，营养价值及保健功能得以提升。

3 结论

探究黑豆水培发芽过程中多酚、黄酮等活性物质和抗氧化活性的变化，结果表明黑豆发芽过程中多酚、黄酮含量呈不断上升趋势，花青素呈下降趋势，相对于萌芽初期，多酚及黄酮含量增加显著（P＜0.05）。黑豆发芽过程中对DPPH·清除率先略微下降后一直上升，对ABTS+·清除率一直增加，对·OH清除率呈现先增加后下降趋势。相关性分析表明，不同发芽期多酚、黄酮含量与其对DPPH·、ABTS+·和·OH清除率均呈一定正相关性（P＜0.05）。试验结果为黑豆的综合利用和进一步开发黑豆芽苗菜功能性食品提供数据支撑。