奶粉中三聚氰胺基质效应的研究及消除

刘超，吕雪梅，景赞

乐山市食品药品检验检测中心（乐山 614000）

三聚氰胺是一种三嗪类含氮环有机化合物[1]，被广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、建筑等领域。由于对身体有害，在世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考中，三聚氰胺就在2B类致癌物清单中[2-4]。三聚氰胺的检测方法主要有重量法、电位滴定法、高效液相色谱法、气质联用法和液质联用法[5-7]。由于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）具有选择性好、分析效率高、灵敏度高、定性能力强、定量准确等优点[8-9]，成为检测原料乳、乳制品及含乳制品中三聚氰胺的主要方法。但液质联用检测食品中三聚氰胺时存在显著的基质效应，必须采取有效的措施减弱或消除基质效应才能得到准确结果[10]。

基质效应是指因目标分析物不稳定或基质中干扰组分让目标分析物发生改变，如聚合、酯化等，或是干扰组分与目标分析物的保留时间相同，干扰组分弱化目标分析物的离子化[11-13]。

基于此，试验考察取样量、净化方式、溶剂种类、溶剂用量、三聚氰胺不同浓度等可能影响基质效应的因素，并采用同位素内标法[14-17]消除样品中的基质效应，提高试验的准确度。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

DGU-20A-API3200高效液相色谱-串联质者仪（AB SCIEX公司）；ES-E120B II电子天平（天津市德安特传感技术有限公司）；TS209358氮吹仪（塔尔博伊斯有限公司）；FUP PT18H高速冷冻离心机（青岛法特通讯科技有限公司）；SHA-B数显恒温水浴振荡器（唐山力辰科技有限公司）；KQ-1000VDE数控超声波清洗机（昆山舒美超声仪器有限公司）；UPA-L超纯水机（唐山力辰科技有限公司）；JRY12固相萃取仪（湖南金蓉仪器设备有限公司）；WCX前处理小柱[60 mg/3 mL，沃特世科技（上海）有限公司]；Cleanert PCX前处理小柱（60 mg/3 mL，天津艾杰尔科技有限公司）；Bond Elut Plexa PCX前处理小柱（60 mg/3 mL，安捷伦科技有限公司）。

1.2 材料与试剂

甲醇、乙腈（均为色谱纯）；三氯乙酸（分析纯）；三聚氰胺标准品（99.0%，批号：G133044，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺内标标准品（Melamine-13 C3 100 μg/mL，坛墨质检科技股份有限公司）；水为实验室一级用水。

奶粉样品：蒙牛成人奶粉、荷兰乳牛中老年配方奶粉、蒙牛女士高钙脱脂奶粉、光明全脂奶粉、河套脱脂奶粉、伊利全脂甜奶粉、飞鹤全脂甜奶粉，均为市售，标为1～7。

1.3 样品处理

采用GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中4.4.1.1提取、4.4.2净化的方法。

1.4 三聚氰胺标准储备液

准确称取10 mg三聚氰胺标准品至10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混匀后备用。

1.5 三聚氰胺标准及内标中间液

三聚氰胺标准中间液：准确移取25 μL三聚氰胺标准储备液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混匀后备用。

三聚氰胺内标中间液：准确移取250 μL三聚氰胺标准储备液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混匀后备用。

1.6 液相色谱-质谱/质谱法检测条件

1.6.1 液相条件

色谱柱为强阳离子交换与C18混合填料，混合比例（1∶4，150 mm×2.0 mm，5 μm）；流动相为乙酸铵溶液-乙腈（1∶1，V/V），用乙酸调至pH 3；进样体积10 μL；柱温40 ℃；流速0.3 mL/min。

1.6.2 质谱条件

扫描方式ESI+；离子喷雾电压4 500 V；雾化气为氮气，30 psi；干燥气为氮气，30 psi；离子化温度450 ℃。

1.7 基质效应评价方法

运用定量测定空白基质提取液与纯溶剂中同浓度分析物的离子响应程度，通过式（1）计算二者比值来评价基质效应。

式中：A和B为基质溶液和纯溶剂分析物的峰面积。A/B＜80%，对分析物的响应产生抑制作用；A/B＞120%，对分析物的响应产生增强作用；80%＜A/B＜120%，不存在基质效应。

1.8 统计分析

采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 取样量对基质效应的影响

各种奶粉分别取0.50和1.00 g（精确至0.01 g）样品，按照1.3进行样品处理，处理后通过LC-MS/MS分析测定并记录三聚氰胺峰面积A和B（A表示基质提取溶液分析物的峰面积，B表示同浓度纯溶剂分析物的峰面积）。将A和B代入式（1）及SPSS 20.0软件，考察不同取样量对基质效应是否有显著性影响，结果见表1和图1。

图1 取样量对不同奶粉三聚氰胺ME的影响

表1 取样量对基质效应的影响

取样量对奶粉中三聚氰胺基质效应的统计分析结果如表1所示。因全粉P值＜0.05，因此取样量对奶粉中三聚氰胺基质效应存在显著性差异，即存在明显基质效应。由图1可知，取样量0.50和1.00 g对奶粉中三聚氰胺的基质效应分别为37.7%～30.6%和21.0%～28.3%。

2.2 溶剂种类对基质效应的影响

各种奶粉分别取4份1.00 g（精确至0.01 g样品），分别编号①②③④。编号①，每份奶粉都加入10 mL水；编号②，每份奶粉都分别加入6 mL三氯乙酸（1%）和4 mL水；编号③，每份奶粉都分别加入10 mL三氯乙酸（1%）；编号④，每份奶粉都分别加入8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈。所有样品超声提取10 min后，按照1.3处理后通过LC-MS/MS分析测定并记录三聚氰胺峰面积A和B（A表示基质提取溶液分析物的峰面积，B表示同浓度纯溶剂分析物的峰面积）。将A和B代入式（1）及SPSS 20.0软件，考察不同取样量对基质效应是否有显著性影响，结果见表2和图2。

图2 不同溶剂对不同奶粉三聚氰胺ME的影响

表2 溶剂种类对基质效应的影响

不同溶剂对奶粉中三聚氰胺基质效应的统计分析结果如表2所示。因奶粉P值均＜0.05，因此溶剂种类对分析奶粉中三聚氰胺基质效应存在显著性差异，即存在明显基质效应。由图2可知，提取溶剂种类对分析物的基质效应差异性除三氯乙酸与V三氯乙酸∶V乙腈=4∶1之间没有显著性差异，其余均有差异显著。进一步计算水、V乙腈∶V水=3∶2、三氯乙酸和V三氯乙酸∶V乙腈=4∶1对奶粉中三聚氰胺的基质效应，分别为30.7%～39.3%，23.8%～32.4%，14.9%～23.1%及15.9%～24.8%。提取溶剂种类对分析物的基质效应差异性除三氯乙酸与V三氯乙酸∶V乙腈=4∶1之间没有显著性差异，不存在基质效应，其余存在基质效应。

2.3 溶剂用量对基质效应的影响

分别取3份各奶粉样品1.00 g（精确至0.01 g），每种奶粉的3份样品分别编号为①②③。编号①，每个样品分别加入4 mL三氯乙酸（1%）和1 mL乙腈；编号②，每个样品分别加入8 mL三氯乙酸（1%）和2 mL乙腈；编号③，每个样品分别加入12 mL三氯乙酸（1%）和3 mL乙腈。按照1.3处理后通过LC-MS/MS分析测定并记录三聚氰胺峰面积A和B（A表示基质提取溶液分析物的峰面积，B表示同浓度纯溶剂分析物的峰面积）。将A和B代入式（1）及SPSS 20.0软件，考察不同取样量对基质效应是否有显著性影响，结果见表3和图3。

图3 溶剂用量对不同奶粉三聚氰胺ME的影响

表3 溶剂用量对基质效应的影响

溶剂用量对奶粉中三聚氰胺基质效应的统计分析结果如表3所示。结合图3可知，溶剂用量对奶粉中三聚氰胺基质效应除10 mL与15 mL无显著性差异，不存在基质效应。其余均存在基质效应。因此溶剂用量是影响奶粉中三聚氰胺基质效应的主要因素之一。由图3可得，溶剂用量为5，10和15 mL对奶粉中三聚氰胺的基质效应，分别为22.1%～32.2%，16.5%～25.5%和12.0%～21.5%。

2.4 不同浓度三聚氰胺对基质效应的影响

分别取各种奶粉样品3份1.00 g（精确至0.01 g），每种奶粉的3份样品分别编号为①②③。按照1.3处理后制备成空白溶液，分别取10，50和100 μL三聚氰胺标准中间溶液，用①②③号各空白容易定容至1 mL，摇匀。通过LC-MS/MS分析测定并记录三聚氰胺峰面积A和B（A表示基质提取溶液分析物的峰面积，B表示同浓度纯溶剂分析物的峰面积）。将各奶粉峰面积A和B代入式（1）及SPSS 20.0软件，考察不同三聚氰胺浓度对基质效应是否有显著性影响，结果见表4和图4。

图4 不同浓度三聚氰胺对不同奶粉三聚氰胺ME的影响

表4 不同浓度三聚氰胺对基质效应的影响

奶粉中不同浓度三聚氰胺对基质效应影响的统计分析结果如表4所示。由表4可知，不同浓度三聚氰胺对基质效应的影响不存在显著性差异，不存在基质效应。

2.5 净化方式对基质效应的影响

分别取各种奶粉4份样品各1.00 g（精确至0.01 g），每种奶粉的4份样品分别编号为a、b、c和d。按照1.3提取后，编号a的待净化液不过柱；编号b的待净化液过WCX固相萃取柱；编号c的待净化液过Cleanert PCX固相萃取柱；编号d的待净化液移过Bond Elut Plexa PCX固相萃取柱。以上溶液分别通过LC-MS/MS分析测定并记录三聚氰胺峰面积A和B（A表示基质提取溶液分析物的峰面积，B表示同浓度纯溶剂分析物的峰面积）。将A和B代入式（1）及SPSS 20.0软件，考察不同取样量对基质效应是否有显著性影响，结果见表5和图5。

图5 净化方式对不同奶粉三聚氰胺ME的影响

表5 净化方式对基质效应的影响

净化方式对奶粉中三聚氰胺基质效应的统计分析结果如表5所示。由图5进一步可知，净化类型不过柱、WCX、Cleanert PCX和Bond Elut Plexa PCX对全脂奶粉中三聚氰胺的基质效应，分别为12.5%～21.2%，15.6%～24.9%，15.1%～26.0%和17.3%～27.0%。

2.6 基质效应的消除

标准曲线的制备：分别移取不同体积的三聚氰胺中间液及相同体积的三聚氰胺内标工作液至6个25 mL容量瓶中，用50%甲醇水定容至刻度，得到质量浓度依次为10，20，40，80，160和200 ng/mL的三聚氰胺标准工作液，每毫升三聚氰胺标准工作液中含有三聚氰胺内标浓度为20 ng/mL。以三聚氰胺浓度为横坐标，三聚氰胺峰面积/内表峰面积为纵坐标得标准曲线回归方程，见表6。

表6 三聚氰胺标准曲线

称取9份空白样品至9支50 mL离心管中，加入20 μL内标中间溶液，分别加入25.0，50.0和100.0 μL三聚氰胺标准中间溶液，按照1.3提取后做三水平三平行回收试验，记录各样品三聚氰胺峰面积和内标峰面积，计算加标回收率。

由表7可知，奶粉回收率在101%～106%之间。数据表明，奶粉回收率较好，内标法彻底消除因基质效应而导致的检测数据不准确，因此内标法能彻底消除三聚氰胺基质效应带来影响。

表7 奶粉加标回收率（n=3）

3 结论

试验借助单因素方差分析探讨取样量、溶剂种类、溶剂用量、不同浓度三聚氰胺、净化方式等因素对奶粉中三聚氰胺基质效应的影响。试验结果表明除了不同浓度三聚氰胺，其余因素均存在明显的基质效应。为消除基质效应带来的检测偏差，试验研究内标法对基质效应的消除，取得明显效果，得到可靠的试验结果。