蛋白激酶B 活性及其级联效应对肉品质的影响

陈晓雨，刘 畅，2，窦 露，杨致昊，特古斯，苏 琳，赵丽华，靳 烨*

（1 内蒙古农业大学食品科学与工程学院 呼和浩特 010018 2 内蒙古化工职业学院 呼和浩特 010018 3 乌拉特中旗农牧和科技局 内蒙古巴彦淖尔 015300）

Akt 为蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB），又称PKB，它是真核细胞中参与蛋白质代谢、糖脂代谢调节、细胞增殖等多种生理生化活动的丝/苏氨酸激酶AGC 家族[1]。Akt 有3 个密切相关且具有85%氨基酸同源性的物质，分别为Akt1、Akt2 和Akt3[2]。其中，Akt1 在平衡肌肉蛋白质方面作用效果显著，在机体众多组织中表达；Akt2 主要在胰岛素敏感组织如棕色脂肪、肝脏以及骨骼肌中表达，它的缺失会导致糖代谢缺陷，还会影响肌肉发育；Akt3 只在机体大脑或睾丸中产生，参与大脑发育和细胞凋亡过程[3]。

Akt 是生长因子受体酪氨酸激酶下游多种信号级联的重要节点，它通过调控下游靶蛋白来调节细胞的能量代谢，从而有助于控制机体的能量平衡。基于此，探究Akt 的活性机制及其级联效应为改善畜禽肉品质相关研究提供参考。

1 Akt 蛋白结构及活性调节

Akt 家族蛋白组成相似，即在氨基端存在1 个典型的pleckstrin 同源（PH）结构域（约110 个氨基酸）、羧基端存在1 个调控结构域以及位于中央的催化结构域（约260 个氨基酸），其中PH 结构域能够激活底物中的丝/苏氨酸残基，该区域一旦发生突变或缺失可导致Akt 活性降低甚至丧失。磷酸化是激活Akt 的主要方式，Akt 的2 个磷酸化调控修饰的活性位点（Ser473 和Thr308），分别位于PH 结构域和羧基末端调节结构域，Akt 在该位点被磷酸化后会达到充分活化的状态[4]。

Akt 活性受多重因素调节，其中主要依赖于磷脂酰肌醇-3 激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信号通路，其次，磷酸肌醇依赖性激酶（3-Phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK）、多种生长因子、某些磷酸酶抑制剂、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和缺氧条件亦会在一定程度上调控Akt 活性[5-6]。

1.1 PI3K 对Akt 的磷酸化调控

PI3K 由p110 催化亚基和p85 调节亚基组成，是一类独特而保守的脂质激酶家族，主要存在于细胞质中，参与蛋白质代谢、细胞增殖、抑制细胞凋亡等多种生化过程[2]。由于其底物特异性、结构与功能存在差异，故将其划分为3 个亚型。I 型、III 型PI3K 是异二聚体，与胰岛素信号传导、细胞增殖、调控细胞凋亡等功能密切相关；II 型PI3K相关研究成果较少，可调节细胞的膜运输功能[7]。在哺乳动物中，PI3K 激活Akt 的典型途径为受体酪氨酸激酶通过与PI3K 中的Src 同源结构域相互结合，被募集到质膜，特异性激活PI3K 生成3，4-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）和3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），而PIP2 能催化Akt 发生二聚体构象改变，随后激活部分Akt[8]。此外，PIP3 会激活含有PH 结构域的下游因子，使更多的二聚体Akt被激活[9]。

1.2 非典型通路Akt 的磷酸化调控

除典型通路外，Akt 还可以被独立于PI3K 的非典型通路激活。PDKs 也可激活Akt，PDK1 是哺乳动物PIP3 结合蛋白的同源蛋白，包含PH 结构域和共识激酶结构域，其中PH 结构域的主要作用是调节PDK1 与PIP2 和PIP3 的相互作用[10]。通常情况下为防止PDK1 激活Akt，PH 结构域与C端的疏水基会折叠在一起[11]。当PDK1 被激活后会转位到细胞膜，此时PI3K 的脂质产物PIP3 诱导Akt 构象改变并暴露出Thr308 位点，PDK1 磷酸化该残基进而激活Akt[12]。Hindie 等[13]发现敲除PDK1 的PH 结构域后，会导致Akt 灭活。此外还有研究表明，不仅PDK1 可以催化Thr308 位点活性，PDK2 也可通过催化磷酸化Ser473 位点使Akt完全活化[14]。

Ser/Thr/Tyr 激酶、核因子κB 激酶抑制剂ε（Ikappa-B kinase epsilon，IKBKE/IKKε）也可在PI3K 非典型通路途径中直接激活Akt，且Akt 被IKBKE 激活时，不受PI3K 或PDK1 的影响[15-16]。此外，抑制活性氧（ROS）也可抑制Akt 的活性[17]。Papaiahgari 等[18]报道当ROS 生成抑制剂存在时，小鼠II 型肺泡上皮细胞诱导的PI3K/Akt 通路激活被抑制。

2 Akt 级联效应及其对肉品质的影响

胰岛素受体与胰岛素受体底物结合磷酸化后，会激活Akt 上游靶蛋白，进而使Akt 也达到磷酸化状态。如图1 所示，Akt 级联效应由Akt 及其下游效应器构成，Akt 磷酸化将激活或抑制下游靶点的活性，进而激活Akt 级联效应，参与调节机体代谢，如蛋白质代谢、糖代谢、脂代谢和细胞凋亡，进而影响肉品的pH 值、嫩度、色泽、风味和持水性等指标。

图1 Akt 级联效应示意图Fig.1 Schematic diagram of Akt cascade

2.1 Akt 通过调节蛋白质代谢影响肉品质

研究表明，Akt 在肌肉蛋白质代谢方面发挥着至关重要的双向调控作用，它既可以通过激活mTOR 来促进蛋白质的合成[19]，又可以诱导叉头转录因子（Forkhead box，FoxO）家族磷酸化失活，从而调控蛋白质的降解[20]（图2）。

图2 Akt 参与调节蛋白质代谢、糖代谢和脂代谢Fig.2 Akt regulates protein metabolism，glucose metabolism and lipid metabolism

mTOR 是Akt 下游效应蛋白，也是翻译和蛋白质合成的关键调控蛋白，具有调控蛋白质翻译、核糖体生物合成等多重生物学功能[21]。mTOR 通过不同的靶点控制肌肉蛋白质的合成，包括激活p70 核糖体蛋白S6 激酶（p70 Ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）的Thr389 位点来介导编码核糖体蛋白mRNA 的翻译起始，提高蛋白质合成速率[22]。Tian 等[23]发现罗伊氏乳杆菌可通过诱导PI3K/Akt 促进肌肉蛋白质合成。真核翻译起始因子4E-结合蛋白1（eIF4E-binding protein 1，4EBP1）也是mTOR 下游最重要的效应体，它是翻译过程的负调控器。在受到外界刺激时，磷酸化的Akt 会刺激mTOR 进一步磷酸化4EBP1 启动翻译过程[24]。

FoxO 家族包括FoxO1、FoxO3、FoxO4 和FoxO6[25]。作为FoxO 家族重要成员之一，FoxO3 蛋白参与了重要生命过程的调控，如蛋白质降解、细胞衰老以及抗氧化应激。FoxO3 是Akt 下游重要转录调节因子之一，Akt 磷酸化降低时，FoxO3 磷酸化随之降低，此时FoxO3 移位于核内并具有活性，促进泛素连接酶等基因的表达，进而加速骨骼肌等肌肉的蛋白质降解[26-27]。FoxO1 也是Akt 重要的下游效应器，在基因表达、翻译后的修饰等多个方面发挥转录活性作用，可以调控肉品质[28]。王建兵[29]发现日粮添加叶绿醇会通过提高Akt、FoxO1活性进而促进肌肉蛋白质沉积。

肌肉蛋白质主要包括肌浆蛋白、肌原纤维蛋白和基质蛋白，目前普遍认为肌肉蛋白与嫩度、风味、色泽和持水性等肉品质有着密切的关系。研究发现肌动蛋白解离会影响肉品嫩度，在一定程度上改善肉品质。肌肉蛋白质降解过程中生成的游离氨基酸和小肽是影响肉品风味形成的关键前体物质[30]。还有学者研究表明，畜禽体内肌红蛋白的自发变化是影响肉品色泽的关键性因素之一，当肌肉中肌红蛋白含量较多时，肉的色泽较好。肌肉细胞蛋白质中，骨架蛋白的降解则与肉品持水性紧密相关[31]。Wojtysiak 等[32]在宰后成熟时发现，肌细胞膜骨架蛋白中的肌营养骨架蛋白发生降解反应会影响肉的持水性。程海星[28]在对苏尼特羊和巴美肉羊测定时发现FoxO1 蛋白表达量升高时，两种羊的剪切力下降，这说明Akt 磷酸化调节FoxO1 与嫩度密切相关。王玲[33]发现FoxO1 和FoxO3 都与肌纤维显著相关，进而影响肉品质。

2.2 Akt 通过调节糖代谢影响肉品质

糖代谢是存在于生物体中最基本的代谢，Akt在糖代谢过程中也发挥着双向调控的作用。目前发现Akt 主要通过以下方式调控糖代谢：促进葡萄糖转运体4（Glucose transporter 4，GLUT4）转位，调节糖代谢[34]；促进糖酵解酶如6-磷酸果糖-2/果糖-2，6-二磷酸酶3（6-Phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-bisphosphatase-3，PFKFB3）活性，加速糖酵解；磷酸化FoxO 和糖原合成酶激酶-3（GSK-3）促进糖原合成和抑制糖异生[35-36]。

研究表明激活的Akt 可通过活化Akt 160 ku的底物（Akt substrate of 160 ku，AS160）来增加机体葡萄糖转运。AS160 是一种GTP 酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP），能够调节3T3-L1 脂肪细胞和L6 成肌细胞中的GLUT4 迁移[37]。GLUT4 在静止状态下被保留在3T3-L1 脂肪细胞的囊泡内，当胰岛素刺激时，AS160 的Thr642 位点被Akt 迅速磷酸化，并从GLUT4 囊泡解离，导致GLUT4 加速胞吐，从而增强细胞膜内GLUT4的积聚以及葡萄糖转运。王建兵[29]以肥胖小鼠为模型时发现口服叶绿醇可通过激活Akt 并提高GLUT4 的表达，进而降低机体血糖和胰岛素水平，从而加速小鼠糖代谢。费烨[38]建立胰岛素抵抗HepG2 细胞模型，观察苦荞清蛋白酶解物可以使磷酸化Akt、PI3K、GLUT4 表达水平极显著上升。郝一铭等[39]通过建立3T3-L1 成熟脂肪细胞胰岛素抵抗模型发现Akt 上游被抑制后，小麦烷基间苯二酚可以激活Akt，并提高下游GLUT4 的基因表达量进而降低胰岛素抵抗。

Akt 通过磷酸化FoxO 和GSK-3 来抑制糖异生并促进糖原合成。Chen 等[40]克隆并鉴定大口黑鲈的FoxO1 基因，探究其在葡萄糖或胰岛素/葡萄糖注射后对糖代谢的影响时发现Akt/FoxO1 途径的磷酸化被显著激活并激活机体糖酵解。Fang等[41]研究表明黄酮类化合物的葡萄糖醛酸代谢物直接靶向Akt 的PH 结构域并激活Akt/GSK-3 信号通路，从而改善大鼠葡萄糖代谢。也有研究证实Akt 通过调节FoxO 增加葡萄糖代谢，从而提高葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate，G6Pase）的活性，Akt 还可以磷酸化并激活PFKFB3，从而诱导糖酵解[42]。

糖酵解是机体中葡萄糖降解途径之一，糖酵解会直接影响pH 值、嫩度等肉品质指标[43]。屠宰后肌肉中Akt 的活性直接改变pH 值降低速率，pH 值变化反映出宰后动物肌肉的糖酵解速率，并且pH 值的改变会显著影响肉色、嫩度、持水力、汁液渗出度等指标[44]。李艳娇[9]的研究表明通过减少30%日粮淀粉含量可显著提高育肥猪猪肉的pH 值，显著降低滴水损失和Akt 蛋白的磷酸化水平。畜禽屠宰后，缺氧条件下的肌肉细胞将激活Akt，加速肌肉糖酵解反应，将糖原转化为乳酸并在体内积累，导致pH 值下降，当糖酵解释放的热能使胴体冷却速度减缓时，低pH 值和高温容易形成PSE（Pale，Soft，Exudative）肉[45]。

2.3 Akt 通过调节脂代谢影响肉品质

Akt 在脂质生物合成、胆固醇导入、脂肪酸合成和氧化或固醇调节元件结合转录因子SREBP（Sterol regulatory element -binding transcription factor）的生成中起着关键作用[46]。其中，SREBPs 是脂质代谢转录调节因子，可抑制糖异生并刺激脂质形成，Akt 可阻止成熟的SREBP-1 降解。Horton等[47]研究表明，Akt 通过大鼠肝细胞中SREBPs 转录因子调控脂质合成。Düvel 等[48]在大鼠脂肪细胞核内发现Akt 介导的mTOR 信号通路促进SREBP1 积累，并诱导SREBP1、固醇和脂肪酸生物合成的基因表达。活化的Akt 会激活mTOR 信号通路促进机体脂肪生成及脂肪细胞分化；此外，mTOR 不仅可以增加SREBP1c 表达，还可诱导内质网应激和未折叠蛋白质反应，促进脂肪合成[49]（图2）。

脂肪是机体中的重要组织，目前已经证实Akt 可促进脂肪合成，影响脂肪沉积，进而影响脂代谢。脂代谢通过改变肌内脂肪含量、机体内脂肪酸组成进而影响肉的色泽、风味、嫩度以及多汁性等[50]。谢晨[51]在对育肥猪脂代谢研究时表明，通过PI3K/Akt 直接下调SREBP-1c 的转录水平，会导致肝脏中脂质沉积变少。Tang 等[52]发现Akt 活性降低会导致脂质合成减少。Dong 等[53]在湖羊饲粮中添加甜菜碱提高了PI3K、mTOR和S6K1基因表达，降低了羔羊腹部脂肪含量，提高了羔羊肌肉脂肪含量，表明通过PI3K/Akt/mTOR 通路可以提高脂肪合成。

2.4 Akt 通过调节细胞凋亡影响肉品质

当细胞受到凋亡刺激时，活化的Akt 可以保护细胞，使细胞免于凋亡[54]。Akt 磷酸化可以使下游效应器如FoxO3、诱导蛋白Bad（促凋亡蛋白）磷酸化，从而抑制细胞凋亡[55]。磷酸化的Akt 可增强抗凋亡蛋白Bcl-2 的活性，降低Bad 的活性。激活的Akt 会催化Bad 磷酸化，并使其与14-3-3 蛋白（接头蛋白）作用释放Bcl-xl（抗凋亡蛋白），抑制机体细胞凋亡；Akt 在催化FoxO3 磷酸化后，Fox-O3 会与14-3-3 蛋白结合并留在细胞质中，从而阻止FoxO3 在细胞核内凋亡[56]。刘祥华等[57]发现大鼠超负荷运动后，针刺刺激可以激活Akt 并抑制下游Bcl-2、Bax（促凋亡蛋白）蛋白的表达，进而抑制肌肉细胞凋亡。

半胱天冬蛋白酶（Caspase-9）是Akt 下游众多底物之一，活化的Akt 会降低Caspase-9 的活性，阻止其下游一系列级联反应，从而减缓机体细胞凋亡进程[58]。目前国内外研究发现细胞凋亡与肉品嫩度紧密相关。Bcl-2 和Bax 是Akt 下游线粒体凋亡途径中重要的调节因子。李兆亭等[59]研究表明牛肉宰后bax/Bcl-2 相对含量显著上升，剪切力显著下降，改善了牛肉嫩度。Akt 通过维持线粒体的结构和功能来促进细胞的存活，通过阻止凋亡因子的释放，抑制细胞凋亡[60]。王琳琳等[61]研究表明茶多酚通过抑制线粒体凋亡途径改善牛肉嫩度。Chaves 等[62]发现Na＋-K＋-ATPase 通过改变膜的通透性，释放细胞色素C 进而激活Caspase，影响肌肉细胞的凋亡和纤维化，使肌质网结构遭到破坏，保水性降低。

3 结论

Akt 是机体细胞内发挥重要作用的丝/苏氨酸蛋白激酶，作用底物丰富，Akt 及其级联效应可调控机体的各种能量代谢，如蛋白质合成、糖酵解、脂肪沉积、脂肪酸氧化以及细胞凋亡，在改善肉品质方面具有重要意义。到目前为止，国内外对Akt的研究主要集中于将其作为癌症、糖尿病和肿瘤等慢性疾病的治疗靶点，对于通过调节Akt 活性来提高肉品品质的研究相对缺乏。Akt 主要通过影响蛋白质代谢、糖脂代谢及细胞凋亡进而影响肉的嫩度、色泽、多汁性等肉品质指标。综上所述，Akt 及其级联效应有可能是改善肉品质的重要靶点。