遵义红茶品质特征及对高脂模型斑马鱼的降脂活性

李茂云，肖 月，钟 凯，吴艳萍*，高 鸿

（1 四川大学轻工科学与工程学院 成都 610065 2 四川大学华西公共卫生学院（华西第四医院） 成都 610065）

遵义红茶（Zunyi black tea），简称“遵义红”“黔红”，属于工夫红茶品类，主要产于贵州省最大的茶叶产区遵义市。遵义低纬度、高海拔、寡日照及多云雾的地理特点为茶树生长提供了绝佳的自然条件。遵义红具有“嫩甜香、鲜爽味”的品质特征，其加工工艺流程包括摊青、萎凋、做型、发酵、干燥和提香。我国不同产地的工夫红茶具有不同的品质特点，如祁门红茶的玫瑰花香、蜜糖香、甜香浓郁，英德红茶“浓、强、鲜”，湖红薯甜香明显，川红香气高锐、持久、带橘香，与上述工夫红茶相比，遵义红的香气特征是具有明显的花果香[1]。红茶的香气和滋味等品质与其内含化学物质密切相关，如香气成分、氨基酸、茶多酚和嘌呤碱等。遵义红茶为贵州省对外重点推荐“三绿一红”名茶之一，然而，目前相关研究较少。

红茶受到全世界消费者的青睐，不仅是因为其醇厚鲜爽的独特滋味，还因其具有抗癌、抗炎、降脂、减肥等多种健康功效。对于降脂减肥功效，越来越多研究证明红茶从调节脂质的消化吸收和分解等多个途径发挥降脂减肥作用[2]。斑马鱼与人类基因相似性较高，是研究基因功能与代谢性疾病的优良模型，具有体积小，繁殖能力强，生命周期短，胚胎和发育初期全身透明便于观察等优点。斑马鱼被证实可用于脂质代谢研究，可在较短时间内对天然活性产物的降脂效果进行分析。有研究通过斑马鱼高脂模型验证了绿茶和黑茶的降脂效果[3-4]。

本文对遵义红茶的特征化学成分包括矿物质元素、挥发性香气成分、游离氨基酸、儿茶素类物质和生物碱类物质进行系统分析，通过电子舌表征遵义红茶的滋味属性，采用高脂饮食诱导的斑马鱼高脂模型研究其降脂活性，以期深入探究遵义红茶的品质特点和健康效应，为提升其品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

遵义红茶（产地贵州省湄潭县），贵州耕田现代农业投资开发有限公司。矿物质元素混标和内标溶液，美国安捷伦公司；没食子酸、表没食子儿茶素（EGC）、儿茶素（C）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和正构烷烃（C7～C30）标准品，美国Sigma-Aldrich；可可碱、茶碱和咖啡碱标准品，四川省维克奇生物科技有限公司；辛伐他汀，上海梯希爱化成工业发展有限公司；0.5%油红O 染液，北京索莱宝科技有限公司；蛋黄粉，上海源叶生物技术有限公司；其它化学试剂，成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

TS 5000Z 味觉分析系统，日本INSENT 公司；QP2010 SE 气相色谱-质谱联用仪GC-MS、RTX-5Sil MS 毛细管柱，日本岛津公司；Med-C 微波消解仪，上海屹尧仪器科技发展有限公司；7700X 电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS，美国安捷伦公司；A300 全自动氨基酸分析仪，德国MembraPure公司；Ultimate 3000 高效液相色谱仪HPLC，美国Thermo Fisher 公司；M205 FA 自动荧光体式显微镜，德国Leica 公司。

1.3 方法

1.3.1 矿物质元素分析 称取0.25 g 磨碎茶样品放入聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL HNO3和1 mL 30%H2O2进行微波消解，分别在120，160，180℃保持10 min。消解完成后，冷却至室温并定容至10 mL，待测。使用外标法对27 种矿物质元素（Li、Be、Na、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Ag、Cd、Cs、Ba、Tl、Pb 和U）进行定量，ICP-MS 仪器参数设定如下：RF 功率为1 550 W；反射功率＜20 W；等离子气流速为15 mL/min；载气流速为1 mL/min；辅助气体流速为1 mL/min；补偿/稀释气体流速为1 mL/min；雾化器温度为2 ℃；蠕动泵转速为0.3 r/s；内标溶液为0.5 mg/L In 和Bi 的混合溶液。

1.3.2 顶空固相微萃取/GC-MS 测定香气成分 顶空固相微萃取：称取1 g 磨碎后样品放入20 mL 顶空瓶中，加入5 mL 沸水后压盖，于60 ℃水浴中磁力搅拌30 min，再使用50/30 μm 萃取头（DVB/CAR/PDMS）于60 ℃水浴下萃取30 min。取出后立即于GC-MS 进样口解吸5 min。

GC 条件：RTX-5Sil MS 毛细管柱（0.25 μm，30 m×0.25 mm）；载气为氦气（＞99.99%），流速1 mL/min；进样口温度为240 ℃；柱温箱升温程序：40 ℃保持3 min 后，以3 ℃/min 速率升至85 ℃保持3 min，再以3 ℃/min 速率升至160 ℃，最后以10 ℃/min 速率升至240 ℃保持5 min。

MS 条件：电离能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；接口温度为280 ℃；质量扫描范围为45～500 m/z。

物质鉴定：采用NIST 14 数据库以及C7～C30正构烷烃辅助定性，结果用相对丰度表示（%）。

1.3.3 电子舌味觉分析系统 根据GB/T 23776-2018《茶叶感官审评方法》[5]中红茶感官审评的茶汤制备方法，使用5 种传感器（AAE、CT0、CA0、C00 和AE1）实现茶汤鲜味、咸味、酸味、苦味、涩味的评价。参比溶液（参比唾液）为氯化钾（30 mmol/L）和酒石酸（0.3 mmol/L）的混合溶液。

1.3.4 氨基酸分析 称取1 g 磨碎后的茶样品加入20 mL 沸水，于沸水浴中搅拌提取30 min，冷却后定容至20 mL，取上清液与10%磺基水杨酸以4∶1（体积比）混合后，静置过夜除蛋白，经0.22 μm 滤膜过滤后待测。使用全自动氨基酸分析仪对20 种氨基酸进行定量分析。

1.3.5 没食子酸、儿茶素类物质和生物碱物质分析 使用70%甲醇水溶液对磨碎后的茶样品进行24 h 搅拌提取（料液比1∶20），经0.22 μm 滤膜过滤后待测。采用外标法对没食子酸、EGC、C、EGCG、EC、ECG、可可碱、茶碱和咖啡碱进行定量分析，HPLC 检测条件设定如下：色谱柱为ODS-4，规格为4.6 mm×250 mm×5 μm；柱温为30℃；流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为甲醇；流速为0.8 mL/min；紫外检测波长为280 nm；进样量为20 μL；流动相洗脱梯度为：0～5 min，5%～22%B；5～20 min，22%B；20～35 min，22%～24%B；35～45 min，24%～25%B；45～50 min，25%～40%B；50～60 min，40%～45%B。

1.3.6 总酚、总黄酮和总碳水化合物测定 样品提取方法与1.3.5 节相同。采用福林酚法测定茶叶中的总酚含量，结果以GA 含量（g/kg）计；采用三氯化铝比色法测定总黄酮含量，结果以芦丁含量（g/kg）计；采用苯酚硫酸法测定总碳水化合物含量，结果以葡萄糖（g/kg）计。

1.3.7 降脂活性分析 采用斑马鱼模型进行降脂活性试验。称取一定量粉碎茶样品，按1∶300 料液比加入沸水，于沸水浴中提取30 min 后过滤。将滤液减压浓缩后，冷冻干燥得红茶水提物。

斑马鱼实验在四川大学生物治疗国家重点实验室完成，按照1∶2 的雌雄比例将5～6 月龄的成年斑马鱼放入带隔板的交配缸，隔开过夜后抽出隔板使之交配产卵（第0 天，0 d.p.f.）。收取鱼卵于28 ℃孵化箱中孵育，前两日9：00 和21：00 分别挑除死卵并换水，接下来每天9：00 换水1 次至第5天，收集第5 天幼鱼（5 d.p.f）构建高脂模型。使用1 mg/mL 蛋黄粉溶液对5 d.p.f 的幼鱼处理48 h后，分别以质量浓度为100，200，400，600，800 μg/mL 的红茶水提物溶液处理斑马鱼48 h，以浓度为0.06 μmol/L 的辛伐他汀作为阳性对照，以新鲜养鱼水和体积分数0.1%的DMSO 为空白对照和溶剂对照。

采用油红O 对处理后的斑马鱼进行染色。收集不同处理组的斑马鱼幼鱼，PBS 清洗后使用4%多聚甲醛溶液于4 ℃固定过夜，再次使用PBS 清洗3 次后，浸泡于60%异丙醇溶液脱水处理30 min，再使用新鲜配制的体积分数0.3%的油红O溶液避光染色3 h。染色结束后，依次使用60%异丙醇和PBS 溶液清洗后，于体式显微镜下观察并拍照。使用Image-Pro Plus 软件对染色斑马鱼进行光密度计算，以光密度值表示斑马鱼体内脂质水平，将高脂组斑马鱼体内的脂质水平表示为100%，其它处理组斑马鱼的脂质水平通过光密度比值换算为相对于高脂组的相对脂质含量。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 遵义红茶中的矿物质元素含量分析

茶叶中的矿物质元素含量与土壤和环境状态息息相关，相关重金属风险也是食品安全的主要关注点之一。如表1 所示，通过ICP-MS 共检测出27 种矿物质元素。其中含量最丰富的是K 元素，高达22 655.89 mg/kg。植物生长需要大量K 元素，K 元素缺乏可导致多种代谢紊乱。K 元素含量与原产地有显著相关性，此外，茶叶特殊配体的结合、茶叶修剪以及钾肥的使用均可导致茶叶中K元素含量升高[3]。红茶所具有的高K 低Na 特性使其对人体健康产生积极的作用[6]。遵义红茶中含量较高的矿物质元素还有Mg、Mn、Ca 和Al 元素。红茶中高含量Mg 元素对预防心血管疾病具有积极作用；微量元素Mn 是超氧化物歧化酶的关键成分，使红茶具有良好的抗氧化活性，且茶汤中Mn元素的生物利用率较高[7]。《食品安全国家标准 食品中污染物限量》（GB 2762-2017）[8]中规定茶叶中Pb≤5 mg/kg，《茶叶中铬、镉、汞、砷及氟化物限量》（NY 659-2003）[9]中规定茶叶中Cr≤5 mg/kg，Cd≤1 mg/kg，As≤2 mg/kg，遵义红茶中检出的As、Cd、Cr 和Pb 含量分别为0.004，0.06，0.71，0.38 mg/kg，均低于以上食品安全标准限量。此外，遵义红茶的Cu 含量为19.07 mg/kg，符合《绿色食品茶叶》（NY/T 288-2018）[10]中规定绿色食品茶叶中Cu≤30 mg/kg 的标准。表明遵义红茶在重金属含量方面具有安全性，且符合绿色食品的规定。

表1 遵义红茶的矿物质元素含量Table 1 Contents of 27 elements in Zunyi black tea

2.2 挥发性香气成分分析

挥发性香气成分是茶叶品质的重要影响因素之一。如表2 所示，采用顶空固相微萃取/GC-MS联用检测方法，在遵义红茶中共检出79 种香气成分，其中包括17 种醛类物质、17 种醇类物质、19种酯类物质、8 种烃类物质、8 种酮类物质、3 种酸类物质以及7 种其它类物质。相对丰度占比较高的为醇类物质（56.49%）、酯类物质（22.04%）和醛类物质（12.02%）。

表2 遵义红茶的香气成分组成Table 2 Composition of volatile aroma in Zunyi black tea

醇类物质中，萜烯醇是遵义红茶中含量最丰富的挥发性物质，如芳樟醇、香叶醇、6，7-环氧芳樟醇、苯乙醇和（E）-芳樟醇氧化物（呋喃），其相对丰度占比分别为36.58%，10.91%，2.67%，2.19%，1.16%，均是具有甜香和花香的物质，且阈值很低[11]。萜烯指数TI 【TI=（芳樟醇+芳樟醇氧化物）/（芳樟醇+芳樟醇氧化物+香叶醇）】可反应香气特征，TI 值高，则香气馥郁怡人，TI 值低，则香气高锐，遵义红茶的TI 值为0.78，其香气属于馥郁怡人型，偏甜香、糖香[12]。芳樟醇和香叶醇可能来源于相关生物合成途径和糖苷水解，在红茶加工过程中，糖苷水解酶基因上调，活性增强，且随着加工过程加深，细胞破裂，糖苷水解酶与基质糖苷接触，进一步产生相关萜烯醇物质[13]。同时，检出的苯乙醇（2.19%）同样可为遵义红茶提供玫瑰花香。酯类物质中，相对丰度占比较高的香气成分为水杨酸甲酯、异硫氰酸烯丙酯和丁酸丁酯，分别为10.46%，6.24%，2.26%。水杨酸甲酯具有花香和较强的冬青油香气，是半发酵茶乌龙茶和全发酵茶红茶的关键差异香气成分[14]。研究显示[11，15]，花香型红茶成品茶中，有杏仁香、焦糖香的苯甲醛和糠醛、有蜂蜜甜香的苯乙醛、有强烈弥散性水果清香香气的（Z）-己酸-3-己烯酯相对含量明显增加，这些物质在遵义红茶中均有检出，相对占比分别为1.02%，1.50%，0.98%，0.36%。此外，在遵义红茶中还检出了较高浓度的具有麦芽香气的2-甲基丁醛（3.03%），具有青草气的2-己烯醛（1.30%）和具有花香、柑橘香和油脂香气的壬醛（1.20%）[11，16]。以上结果表示，遵义红茶属于偏甜香的花果香型红茶。

2.3 滋味属性结果和滋味相关化学成分分析

电子舌味觉分析系统可以通过检测各种风味物质和人工脂膜之间的静电作用或疏水性相互作用产生的膜电势的变化，实现对5 种味（酸、苦、咸、鲜和涩味）的评价。参比溶液的输出值表示无味点，如图1 所示，可知遵义红茶的酸味和涩味值均在无味点以下，苦味值与无味点基本重合，即遵义红茶没有酸味、涩味和苦味，具有较弱的苦味回味、涩味回味，而具有较强的咸味、鲜味，同时具有较高的鲜味持久度（丰富度）。茶叶中影响滋味的物质主要包括氨基酸、茶多酚类物质、生物碱类物质和可溶性糖等。

图1 遵义红茶的滋味特征Fig.1 Taste characteristics of Zunyi black tea

氨基酸是影响茶汤鲜爽滋味的重要因素。遵义红茶中的游离氨基酸含量如表3 所示，在遵义红茶中氨基酸总含量为10 396.67 mg/kg，包括7种必需氨基酸、11 种非必需氨基酸和2 种其它氨基酸。研究显示茶氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺在红茶中含量较高[17]，其含量范围分别为223～2 186，26.5～317.9，227～1 086，223～2 186，70～1 603 mg/kg。在遵义红茶中，上述氨基酸含量分别为3 443.33，1 520.00，290.00，566.67，690.00 mg/kg。与其它红茶相比，遵义红茶中茶氨酸和γ-氨基丁酸含量均处于较高水平。茶氨酸是红茶鲜爽度的主要影响因素，与茶叶品质呈显著正相关[18]，可由谷氨酸经茶氨酸合成酶转化。遵义红茶中γ-氨基丁酸含量接近富γ-氨基丁酸红茶（1 620 mg/kg），γ-氨基丁酸具有降血压，改善失眠，增强记忆等多种功能，可在低氧胁迫条件下由谷氨酸脱羧转化而来，此外天冬氨酸和天冬酰胺都是合成谷氨酸的前体物质。因而，茶氨酸和γ-氨基丁酸的高含量可能导致谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺通过氮途径转化含量降低[19]。此外谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺均具有显著鲜味，也为遵义红茶贡献了一定的鲜爽度；γ-氨基丁酸被认为口感干爽，有醇和的涩味[20]。遵义红茶中还检测到了部分甜味氨基酸，包括苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸，其它氨基酸（除瓜氨酸）均是带苦味的氨基酸[20]。回甘、回甜是红茶的滋味特征之一，除甜味氨基酸外，茶叶中的水溶性碳水化合物也是其甜味来源。研究显示，不同级别和产地的祁门红茶中可溶性糖含量为30.1～43.3 g/kg[21]，遵义红中可溶性碳水化合物含量为57.53 g/kg（表4），高于祁门红特茗茶，这可能使得遵义红茶茶汤甜醇度增加。

表3 遵义红茶中的游离氨基酸含量Table 3 Contents of free amino acids in Zunyi black tea

表4 遵义红茶中的其它化学物质含量Table 4 Other chemical components in Zunyi black tea

通过HPLC 检测了遵义红茶中没食子酸、5种儿茶素类物质（EC、C、ECG、EGC、EGCG）以及3种生物碱物质（咖啡碱、可可碱、茶碱）的含量，其结果如表4 所示，其中没食子酸含量为3.80 g/kg；儿茶素类物质中含量最高的为ECG（17.50 g/kg），其次为EGCG、EGC、EC 和C，含量分别为4.56，2.13，0.78，0.15 g/kg。生物碱物质中含量最高的是咖啡碱（7.21 g/kg），其次为可可碱（5.06 g/kg）和茶碱（0.51 g/kg）。遵义红茶中总酚、总黄酮含量分别为184.46 g/kg 和170.64 g/kg。与前人报道的结果相比较，遵义红茶中茶多酚类物质和黄酮类物质含量略高，咖啡碱含量较低[12]，儿茶素单体含量趋势与前人报道一致[21]。茶多酚等物质会在萎凋、揉捻、发酵等制作过程中因植物细胞破损而释放，也与茶叶原料品种、采摘时间等具有一定相关性。儿茶素类等酚类物质以及黄酮类物质均具有明显的涩味和苦味，而咖啡碱具有明显的苦味，是红茶苦涩味的重要来源[20]。电子舌结果显示遵义红茶不具有苦味及涩味，茶多酚类物质及咖啡碱可能仅为遵义红茶提供较弱的苦味回味和涩味回味。

2.4 降脂分析

采用斑马鱼高脂模型探究遵义红茶的降脂活性，如图2a 所示，通过油红O 对斑马鱼体内的中性脂质进行染色，可直观观察斑马鱼体内的脂质水平。蛋黄粉喂养后的斑马鱼体内油红O 染色面积增大且染色强度增加，经辛伐他汀或不同浓度遵义红茶水提物处理48 h 后，染色面积和强度明显减少。如图2b 所示，以高脂组斑马鱼体内脂质水平为100%，与高脂组相比，未经高脂处理的正常对照组相对脂质含量为4.95%，阳性对照辛伐他汀组相对脂质含量为25.33%，均显著低于高脂组（P＜0.05），溶剂对照组与高脂斑马鱼相对脂质含量无显著差异（P＞0.05）。以上结果说明斑马鱼高脂模型造模成功，且辛伐他汀药物能降低高脂斑马鱼脂质水平，溶剂DMSO 对高脂斑马鱼体内脂质水平无显著影响。不同浓度的遵义红茶水提物均能够降低高脂斑马鱼体内的脂质水平，高脂斑马鱼分别经质量浓度为100，200，400，600，800 g/mL 的遵义红茶水提物处理48 h 后，相对脂质含量分别降至60.48%，56.97%，54.16%，49.74%，45.02%（P＜0.05），其降脂效果具有一定剂量依赖性。

图2 遵义红茶水提物的降脂活性Fig.2 Hypolipidemic activity of water extract of Zunyi black tea

高脂高糖饮食导致的肥胖、胰岛素抵抗、脂肪肝、高血脂等症状已成为21 世纪公众所面临的巨大挑战，然而，使用药物干预往往有血压升高、精神失常、头痛和失眠等副作用，因而通过饮食干预达到降脂减肥效果具有更好的前景。越来越多证据表示红茶对于预防肥胖有积极影响，且其主要功能物质为茶黄素等红茶多酚。对于高脂饮食喂养的小鼠，红茶可以减少内脏脂肪，其效果优于乌龙茶、普洱茶，且动物实验结果显示茶黄素饮食干预对于胆固醇、LDL、HDL 含量的调节效果优于茶红素[23]，人群研究结果显示茶黄素干预后，受试人群的体重、体脂率和皮下脂肪数据明显低于儿茶素组及安慰剂组[24]。

红茶及其功能物质的降脂活性主要通过影响脂质的吸收、代谢和累积实现。红茶可以通过影响胆固醇胶束体形成、胰脂酶活性来抑制小肠脂质吸收。红茶多酚可以降低体外胆固醇胶束体溶解度，抑制胆固醇胶束体的形成，形成得具有洋葱结构的不溶性多层大囊泡，这种多层囊泡主要由茶黄素单体茶黄素-3-没食子酸酯作用形成[25]；且对于不溶性多层大囊泡的形成，部分茶黄素单体效果优于ECG、EGCG[26]。红茶多酚及茶黄素单体对体外胰脂酶的活性有明显抑制作用，且抑制效果优于茶红素、EGCG 及ECG；有没食子酸酯基存在的茶黄素单体对胰脂酶有更强的抑制效果，计算机模拟研究显示其机制可能是上述茶黄素单体的没食子酸酯基的羟基与胰脂酶的Asn263 和Asp206 位点结合，以及干扰His264 位点的质子化，以抑制胰脂酶活性位点[23，27-28]。此外，红茶提取物及茶黄素可以通过下调PI3K/Akt/Sp-1 信号转导通路，抑制脂肪氧合酶FAS 的过表达，以及激活SIRT6/AMPK/SREBP-1/FASN 信号通路，抑制肝脏脂质的合成与累积，降低高脂饮食小鼠的TC、TG 和LDL 水平，抑制ALT 和AST 的活性，改善高脂饮食诱导的肝损伤[29-30]。红茶提取物可以降低高脂饮食大鼠体脂比和肝脏脂质液滴的数量，显著缓解脂肪沉积和高脂饮食引发的非酒精性脂肪肝病，茶黄素单体茶黄素-3，3'-双没食子酸酯可以抑制脂肪细胞中的甘油三酯累积，其机制均可能与能量消耗、脂质分解及β-氧化相关的基因表达上调有关，包括激活AMPK 并导致脂肪分解基因的反式激活因子PPARα 的上调，从而抑制脂肪细胞中的脂质累积[31-32]。

3 结论

本研究对遵义红茶的特征理化成分和降脂活性进行了系统的探究，结果显示，遵义红茶中的K、Mg、Mn、Ca 和Al 元素含量丰富，有害重金属元素如As、Cd、Cr 和Pb 等含量均符合相关食品标准限量规定；遵义红茶中醇类、酯类和醛类挥发性成分丰度占比较高，甜香、花香型物质如芳樟醇、香叶醇、芳樟醇氧化物、苯乙醇等含量丰富，属于偏甜香的花果香型红茶；遵义红茶中鲜味氨基酸如茶氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸含量较高，且电子舌结果表明遵义红茶具有较强的鲜味，不具有涩味和苦味。此外，遵义红茶水提物对高脂模型斑马鱼具有显著的降脂活性，在100～800 μg/mL 范围内呈剂量依赖地降低高脂斑马鱼体内脂质水平。