地参结合酚提取物体外保肝作用

高春燕，杨文艺，洪 玥，张天阳，李 望，李媛丽，卢跃红*

（1 北方民族大学生物科学与工程学院 银川 750021 2 大理大学公共卫生学院 云南大理 671000）

肝脏疾病是最常见的慢性疾病，包括肝炎、肝硬化、纤维化和肝细胞癌，已成为死亡和疾病的首要原因之一[1]。许多因素，如营养不足、病毒感染、酒精和药物依赖、异生物暴露和代谢性疾病，都参与了肝脏疾病的产生和进一步发展[2]。根据全球疾病负担（GBD）相关数据，近年来因肝脏疾病而死亡的人数有二百多万，约占全球总死亡人数的百分之四[3]。肝脏疾病正成为一个相当大的公共卫生负担。CCl4是一种常用于肝损伤模型的化学制剂，经代谢产生活性氧自由基，进一步与细胞分子结合，诱导氧化应激反应的发生，从而导致细胞损伤、炎症和凋亡[4]。据报道，植物酚类化合物可以改善氧化应激和炎症引起的肝损伤，并预防肝脏疾病的发生[5-8]。

地参（Lycopus lucidusTurcz.），系唇形科（Labiatae）地笋属多年生草本植物，属云南高原特色食品资源，以大理剑川沙溪镇分布最为广泛，且品质最优。民间传统以炒食、做汤、油炸、腌渍食用为主。地参富含矿物质、有机酸、维生素、粗脂肪、氨基酸和酚类化合物等营养成分[9-12]，具有降血糖[13-14]，降血脂[13]，抑制体外肿瘤细胞生长[15]，抗D-半乳糖所致小鼠衰老[16]，提高免疫功能[17]，抑制消化酶[18-19]，抗氧化[11-12，20-21]，保肝[7，22]等多方面生理功能。

植物多酚以游离和结合两种形式存在于植物体内，与游离酚相比，结合酚是与其它物质结合而存在的酚类化合物。前期研究显示[11-12，20-21]，地参结合酚含量丰富，主要含有的单体酚类化合物为咖啡酸，且具有显著的抗氧化活性，而肝损伤通常伴随着氧化损伤。本研究采用体外CCl4损伤肝细胞模型，通过细胞存活率和肝功能指标（ALT、AST 和LDH）评价地参结合酚的体外保肝作用。同时，检测脂质过氧化产物、抗氧化指标（SOD 和GSH）、炎症反应因子（TNF-α、IL-6 和IL-8）、Caspase-3 活化程度、细胞凋亡及线粒体膜电位的变化，从抗氧化，抑制炎症反应和细胞凋亡，保护线粒体的角度揭示地参结合酚对CCl4损伤肝细胞的保护作用机制，以期为地参功能食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

地参，采于云南省剑川县沙溪镇；BRL 大鼠肝细胞，中国科学院细胞库；Annexin V-FITC 细胞凋亡试剂盒、Caspase-3 活性测试盒、细胞MDA 测定试剂盒、总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-8、IL-6 检测试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1），上海碧云天生物技术有限公司。

ELx800 全自动酶标仪，美国Bio-Tek 基因有限公司；FACSCalibur 流式细胞仪，美国Becton Dickinson 公司；日立-7180 生化分析仪，日本日立公司；TCS SP8 激光共聚焦显微镜，德国Leica 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 地参结合酚的提取及纯化 按照文献[18]的方法提取地参结合酚并纯化。具体流程：地参粉末5.0 g→80%的甲醇超声波辅助提取3 次→抽滤→残渣以4 mol/L NaOH 水解4 h→调pH 值至1～2→抽滤→滤液用乙酸乙酯萃取→合并乙酸乙酯相→旋转蒸发→浓缩液蒸馏水并定容15 mL→加入X-5 大孔树脂吸附24 h→抽滤→大孔树脂以70%的乙醇解析24 h→抽滤→滤液旋蒸→浓缩液真空冷冻干燥→地参结合酚纯化物。

1.2.2 细胞毒性的测定 BRL 大鼠肝细胞悬液（2.5×104/mL）→100 μL/孔接种于96 孔板（空白对照组加培养液）→培养12 h→干预组加入100 μL 0.2～1.6 mg/mL 的地参结合酚溶液（先用PBS 配制成质量浓度为5 mg/mL，再用培养液稀释至各浓度），正常组和空白对照组加入100 μL 培养液→培养4 h→加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL）→培养4 h→吸走上清液→加入150 μL DMSO→避光低速振荡15 min→测定吸光度值（490 nm）→计算细胞存活率。

1.2.3 细胞存活率的测定 按照1.2.2 节方法种板→培养12 h→干预组加入100 μL 0.4～1.6 mg/mL 的地参结合酚溶液，正常组、损伤组和空白对照组加入100 μL 培养液→培养4 h→干预组和损伤组加入40 μL CCl4（100 mmol/L），正常组和空白对照组加入40 μL 培养液→培养3 h→测定细胞存活率。

1.2.4 ALT、AST 和LDH 的测定 BRL 大鼠肝细胞悬液（5×104/mL）→500 μL/孔接种于24 孔板→培养24 h→干预组加入500 μL 0.4～1.6 mg/mL 的地参结合酚溶液，正常组、损伤组和空白对照组加入500 μL 培养液→培养4 h→干预组和损伤组加入200 μL CCl4（100 mmol/L），正常组和空白对照组加入200 μL 培养液→培养3 h→离心→收集上清→测定。

1.2.5 MDA、SOD 和GSH 的测定 根据试剂盒说明书操作，具体流程：按照1.2.4 节方法培养各组细胞→离心→收集上清→测定。MDA、SOD 和GSH 的测定结果分别以nmol/mL、U/mL 和μmol/L表示。

1.2.6 TNF-α、IL-6 和IL-8 的测定 根据试剂盒说明书操作，具体流程：按照1.2.4 节方法培养各组细胞→裂解细胞→离心→收集上清→测定。结果均表示为pg/mL。以浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得TNF-α、IL-6 和IL-8 的标准曲线方程分别为A=0.0042C ＋0.0439（R=0.9912，线性范围为0～320 pg/mL），A=0.0101C-0.0101（R=0.9995，线性范围为0～160 pg/mL）和A=0.0069C ＋0.0014（R=0.9992，线性范围为0～240 pg/mL）。

1.2.7 细胞凋亡的检测 根据Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，具体流程：按照1.2.4 节方法培养各组细胞→收集各孔细胞培养液→D-PBS 洗涤细胞→胰酶消化细胞1～2 min→加入对应各孔收集的细胞培养液→混匀→离心→弃上清→收集细胞→D-PBS 重悬细胞→取5×105/mL 的细胞悬液→离心→弃上清→加500 μL 结合液轻轻重悬细胞→加入5 μL Annexin V-FITC→5 μL 碘化丙啶→混匀→25 ℃暗室放置10 min→流式细胞仪检测。

1.2.8 Caspase-3 活化程度的测定 按Caspase-3活性测试盒说明书操作，具体流程：按照1.2.4 节方法培养各组细胞→裂解细胞→收集培养液→离心→取上清液→测定。Caspase-3 活化程度以OD样品/OD空白对照值来表示。

1.2.9 细胞膜电位的测定 根据试剂盒说明书操作，具体流程：按照1.2.4 节方法培养各组细胞→吸除培养液→PBS 洗涤细胞→加入1 mL 细胞培养液→加入1 mL JC-1 染色工作液→混匀→37 ℃孵育20 min→吸弃上清→JC-1 染色缓冲液洗涤2次→加入2 mL 细胞培养液→激光共聚焦显微镜拍照。

1.3 数据处理

各试验组分别设置5 个复孔，数据以“x¯ ±s“表示，采用SPSS 17.0 软件ANOVA 进行差异统计学检验，采用Pearson 对各检测指标的相关性进行分析。

2 结果与分析

2.1 细胞毒性

地参结合酚细胞毒性测定结果见表1。在0.2～1.6 mg/mL 干预范围，细胞存活率在90.51%～92.27%，与正常组之间无统计学差异（P＞0.05），表明在该浓度范围，地参结合酚无细胞毒性，可以开展地参结合酚对肝细胞损伤保护作用的后续试验。

表1 细胞毒性测定结果Table 1 Results of cytotoxicity assays

2.2 地参结合酚对CCl4 损伤肝细胞细胞存活率、ALT、AST 和LDH 的影响

地参结合酚对CCl4损伤肝细胞细胞存活率、ALT、AST 和LDH 的影响见表2。就细胞存活率而言，CCl4损伤组比正常组下降了74.48%；0.4，0.8，1.6 mg/mL 地参结合酚干预组比CCl4损伤组分别增加了1.25，1.71 倍和2.08 倍。就ALT、AST 和LDH 而言，CCl4损伤组比正常组分别增加了0.96，2.57 倍和1.13 倍；地参结合酚干预组与CCl4损伤组相比，均有不同程度的下降，且呈剂量效应关系。当干预剂量为1.6 mg/mL 时，ALT、AST 和LDH的水平分别下降41.13%，21.57%和15.94%。

表2 地参结合酚对CCl4 损伤肝细胞细胞存活率、ALT、AST 和LDH 的影响Table 2 Effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.on cell viability，ALT，AST and LDH in CCl4-injured hepatocytes

LDH 从细胞中的释放是对凋亡信号的回应，LDH 的水平是细胞凋亡的有效指标[23]。同样，ALT和AST 是肝细胞功能受损的重要指标。ALT、AST和LDH 大量释放，进入细胞培养液，表明CCl4对肝细胞的损伤造成细胞膜功能的严重受损，使其通透性增加。地参结合酚预处理显著降低了ALT、AST 和LDH 的水平，表明其对体外CCl4损伤肝细胞具有显著的保护作用。

2.3 地参结合酚对CCl4 损伤肝细胞MDA、GSH和SOD 水平的影响

地参结合酚对CCl4损伤肝细胞MDA、GSH和SOD 水平的影响见图1。就MDA 含量而言，CCl4损伤组比正常组增加了1.61 倍；0.4，0.8，1.6 mg/mL 地参结合酚干预组比CCl4损伤组分别减少了47.76%，50.31%和52.83%。就GSH 和SOD 含量而言，CCl4损伤组比正常组分别下降了45.12%和67.18%；地参结合酚干预组与CCl4损伤组相比，均有不同程度的上升，且呈现剂量效应关系。当干预剂量为1.6 mg/mL 时，GSH 和SOD 的水平分别增加了55.56%和172.01%。

图1 地参结合酚对CCl4 损伤肝细胞MDA、SOD 和GSH 水平的影响Fig.1 Effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.on the levels of MDA，SOD and GSH in CCl4-injured hepatocytes

CCl4通过自由基和过氧化作用引起肝细胞的损伤，其产生的反应代谢性自由基攻击并破坏多不饱和脂肪酸，尤其是那些与磷脂相关的脂肪酸，进而导致肝细胞中的脂质过氧化[24]，可对其终产物MDA 的含量进行表征。SOD 通过催化ROO·与质子结合，进一步形成过氧化氢和氧，从而促进ROO·的分解[25]。GSH 对CCl4毒性衍生物的解毒有很大贡献，当GSH 存储明显耗尽时，肝细胞坏死开始[26]。CCl4损伤组MDA 含量显著增加，GSH 和SOD 含量显著下降，表明肝细胞脂质过氧化程度严重，细胞处于氧化损伤状态。地参结合酚抑制了CCl4损伤引起的肝细胞MDA 的增加和GSH 和SOD 的下降，表明其抑制了肝细胞的脂质过氧化，提高了抗氧化酶的活性，从而发挥对肝细胞损伤的保护作用。

2.4 地参结合酚对CCl4 损伤肝细胞TNF-α、IL-6 和IL-8 水平的影响

地参结合酚对CCl4损伤肝细胞TNF-α、IL-6和IL-8 水平的影响见图2。CCl4损伤组与正常组相比，TNF-α、IL-6 和IL-8 的水平分别增加了95.61%，75.87%和41.89%。地参结合酚干预组与CCl4损伤组相比，TNF-α、IL-6 和IL-8 水平均显著下降，且呈现剂量效应关系。当地参结合酚干预剂量为1.6 mg/mL 时，TNF-α、IL-6 和IL-8 水平分别下降了41.72%，21.49%和21.59%。

图2 地参结合酚对CCl4 损伤肝细胞TNF-α、IL-6 和IL-8 水平的影响Fig.2 Effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.on TNF-α，IL-6 and IL-8 levels in CCL4-injured hepatocytes

CCl4产生的活性氧（ROS）激活了肝细胞内在免疫系统和Kupff 细胞，通过产生更多的ROS 和前炎症细胞因子加剧了肝细胞的炎症损伤[27]。肿瘤坏死因子（TNF-α）作为CCl4介导的肝损伤炎症介质，刺激细胞因子从巨噬细胞中释放出来，并诱发吞噬细胞的氧化代谢和NO 的产生[28]。NO 是反应活性更高的氧化物，它由iNOS 产生，通过与ROS 反应和形成过氧亚硝基增强了氧化应激[29]。TNF-α 还可引起许多与肝细胞损伤有关的第二介质，如IL-1β、IL-6、IL-8 及蛋白酶等的出现。CCl4损伤组TNF-α、IL-6 和IL-8 水平的显著提升，表明肝细胞发生严重的炎症反应，地参结合酚干预组TNF-α、IL-6 和IL-8 水平的显著下降，表明地参结合酚抑制炎症反应，从而发挥对肝细胞损伤的保护作用。

2.5 地参结合酚对CCl4 损伤肝细胞凋亡的影响

地参结合酚对CCl4损伤肝细胞凋亡的影响见图3。图中左下象限为正常细胞，左上象限为坏死细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限为晚期凋亡细胞。CCl4损伤组（图3b）与正常组（图3a）相比，正常细胞显著减少，凋亡细胞显著增加；地参结合酚干预组（图3c、3d 和3e）与CCl4损伤组相比，随着干预剂量的增加，正常细胞逐渐增多，凋亡细胞逐渐减少。定量分析结果（图4）表明，CCl4损伤组与正常组相比，正常细胞减少了38.48%，坏死细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞分别增加了22.99%，234.54%和140.39%，表明CCl4导致肝细胞的坏死和凋亡。地参结合酚干预组与CCl4损伤组相比，干预剂量为0.4，0.8 mg/mL和1.6 mg/mL 时，正常细胞分别增加了29.07%，41.37%和49.83%，坏死细胞分别减少了34.34%，9.66%和3.62%，早期凋亡细胞分别减少了29.87%，52.22%和56.87%，晚期凋亡细胞分别减少了25.81%，45.55%和53.06%，这表明地参结合酚在一定程度上可以降低细胞凋亡率，抑制肝细胞坏死，从而发挥对肝细胞损伤的保护作用。

图3 地参结合酚对CCl4 损伤肝细胞凋亡的影响Fig.3 Effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.on CC14-injured hepatocyte apoptosis

图4 肝细胞凋亡的定量分析Fig.4 Quantitative analysis of the hepatocyte apoptosis

2.6 地参结合酚对CCl4 损伤肝细胞Caspase-3活化程度的影响

地参结合酚对CCl4损伤肝细胞Caspase-3 活化程度的影响见图5。CCl4损伤组与正常组相比，Caspase-3 活化程度增加了44.87%。地参结合酚干预组与CCl4损伤组相比，干预剂量为0.4，0.8 mg/mL 和1.6 mg/mL 时，Caspase-3 活化程度分别减少了14.16%，15.49%和18.58%。

图5 地参结合酚对CCl4 损伤肝细胞Caspase-3活化程度的影响Fig.5 Effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.on the activation of Caspase-3 in CCl4-injured hepatocytes

Caspase-3，又称为胱氨酸蛋白酶3，参与细胞凋亡的执行，是细胞凋亡的效应者。异源活化后的Caspase-3 酶解切割胞内重要的蛋白质，使DFF-45（DNA fragmentation factor-45）、DNA 依赖的蛋白激酶（DNA-PK）、多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP，poly（ADP-ribose）polymerase）降解[30]，从而阻止DNA 的修复，并导致DNA 的降解，致细胞凋亡。Caspase-3 的活化程度可以反映细胞凋亡的情况。试验结果显示，CCl4使细胞发生明显的的凋亡，而地参结合酚可通过阻滞Caspase-3 的活化，抑制细胞凋亡。

2.7 相关性分析

为了进一步研究所检测各指标间的关联，进行相关性分析，结果见图6。ALT、Caspase-3、TNFα、IL-6 和IL-8 之间具有显著的正相关性，这与崔健娇等[31]研究结果一致，表明CCl4损伤肝细胞使转氨酶释放并伴随着炎症反应和细胞的凋亡。相反，GSH 和SOD 与ALT、Caspase-3、TNF-α、IL-6、IL-8 间具有显著的负相关性，表明地参结合酚通过抗氧化作用抑制CCl4引起的肝细胞的炎症反应和凋亡，从而发挥保护肝细胞损伤的作用。

图6 相关性分析热图Fig.6 Heatmap of correlation analysis

2.8 地参结合酚对CCl4 损伤肝细胞线粒体膜电位（ΔΨm）的影响

地参结合酚对CCl4损伤肝细胞ΔΨm的影响见图7。正常细胞ΔΨm较高，JC-1 以聚合物的形式存在于线粒体中，可以显示红色荧光（图7A）；CCl4产生的自由基和脂质过氧化导致线粒体DNA 的消耗和损伤以及超微结构的改变[32]，进而导致ΔΨm的降低，此时JC-1 以单体（Monomer）的形式存在，可以显示绿色荧光（图7B）。线粒体膜电位的显著降低意味着膜通透性和完整性受到严重损害[32]。线粒体通透和功能障碍，使线粒体上的膜透过性转换孔开放，释放出大量的促凋亡蛋白和细胞色素C[33]，进一步诱发细胞的凋亡[34]。试验结果表明，地参结合酚随着干预浓度的升高，红色荧光逐渐加强（图7C～7E），提示地参结合酚干预可显著抑制CC14诱导的ΔΨm的降低，稳定线粒体的功能，同时具有抑制肝细胞凋亡的作用，这与Caspase-3 活化程度的测定结果一致。

图7 地参结合酚对CCl4 损伤肝细胞线粒体膜电位的影响Fig.7 Effects of bound phenolics from Lycopus lucidus Turcz.on mitochondrial membrane potential in CCl4-injured hepatocytes

细胞凋亡受到两条基本途径的调控：死亡受体介导的（外源性）途径和线粒体（内源性）途径[35]。在外源性途径中，配体与死亡受体（DR）之间的相互作用始于质膜，然后激活Caspase-8，从而直接激活Caspase-3 的下游作用[36]。在内源性途径中，细胞凋亡使线粒体外膜的通透性增加，从而将溶解的蛋白从线粒体内部释放到细胞质中，进一步激活Caspase 破坏细胞[37]。试验结果显示，地参结合酚通过抑制Caspase-3 的活化和保护线粒体抑制CC14引起的肝细胞的凋亡。

3 结论

地参结合酚在干预剂量范围无细胞毒性，能抑制CCl4导致的细胞存活率、MDA、SOD 和GSH的降低，以及ALT、AST、LDH、TNF-α、IL-6、IL-8和Caspase-3 活化程度的升高；同时，能显著降低CCl4引起的细胞凋亡和线粒体膜电位的降低。相关性分析结果显示，ALT、Caspase-3、TNF-α、IL-6和IL-8 之间具有显著正相关，GSH 和SOD 与ALT、Caspase-3、TNF-α、IL-6、IL-8 之间具有显著负相关。研究结果表明，CCl4损伤肝细胞产生了氧化损伤，并伴随着炎症反应、细胞凋亡和线粒体膜电位的改变。地参结合酚通过抗氧化、抑制炎症反应和细胞凋亡及保护线粒体的功能，发挥对CCl4损伤肝细胞的保护作用。今后可从信号转导通路揭示其抗氧化、抑制炎症反应和细胞凋亡的分子机制，为开发地参保肝功能性食品提供理论参考。