青稞麦麸γ-氨基丁酸的制备条件优化

江 迪，张紫晋，杨 婷，2，赵 爽，4，彭 君，蒲邓佳，2，陈 静*

（1 中国科学院成都生物研究所 成都 610041 2 四川农业大学 四川雅安 625014 3 西藏自治区农牧科学院农业资源与环境研究所 拉萨 850000 4 云南农业大学 昆明 650500）

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyricacid，GABA）是一种广泛分布于动、植物和微生物中的非蛋白质氨基酸[1]，是存在于哺乳动物脑、脊髓中的一种重要的抑制性神经传递物质[2]，具有降血压[3-4]，抗抑郁[5-6]，增强脑功能[7-8]等生理活性，在功能性食品领域有着巨大的应用前景[9]。GABA 主要由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）催化转化而来[10]，其制备方法主要有化学合成法和生物合成法两大类[11]。化学合成法虽然反应速度快，得率高，但是副反应多，有化学物质残留，不符合现代工业绿色环保的发展理念[12]。生物合成法又分为微生物转化法和植物富集法[13]，其原理是利用微生物与植物中的内源GAD 将谷氨酸（Glu）及其钠盐转化成GABA。微生物转化存在高效菌株难获得，发酵液成分复杂，生产的GABA 需进一步纯化等问题[14]。常见的植物富集法，如利用大豆[15]、水稻[16]等谷物籽粒进行发芽或发酵处理富集GABA，则存在得率低，操作步骤多，pH 调控严等不同程度的局限性，不能满足食品工业大规模生产的需要。

近年来，全球对营养健康功能食品和保健品的需求持续增加，探索低成本、环境友好、食物源的GABA 高效富集方法十分重要[17]。到目前为止，国内外利用米糠[18]、玉米胚芽[19]等农业副产物转化GABA 的研究较多，然而，利用麦麸制备GABA 的报道较少。廖周华等[20]以脱脂小麦麦麸为原料，通过正交试验优化富集工艺得到的GABA 产量为3.81 mg/g（4 mmol/L）。Jin 等[21]和Limure 等[22]以裸大麦麦麸为原料，通过对外源添加谷氨酸钠和辅酶以及反应条件的单因素优化，GABA 生成量达到11 mmol/L，转化率为92%。青藏高原裸大麦（亦称青稞）是栽培大麦的一个变种，也是种植面积最大的高原粮食作物[23]。本试验通过对青稞品种选择、麸皮分级制备方法和GABA 合成工艺优化等研究，建立一种利用青稞麸皮制备GABA 的安全、高效的方法，从而为高附加值GABA 功能食品和保健品生产提供可靠的原料生产途径，以提高农业资源的利用率和种植效益。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

供试材料：15 份青稞品种，种植于四川什邡，常规田间管理，收获成熟籽粒用于后续研究。

主要试剂：GABA 标准品，上海麦克林生化科技有限公司；谷氨酸钠、磷酸吡哆醛，上海源叶生物科技有限公司；硼酸、四硼酸钠、苯酚、次氯酸钠、无水乙醇、盐酸，成都海鸿实验仪器有限公司。本试验使用的化学药品均为分析纯级。

主要仪器与设备：SCIENTZ 高通量组织研磨器，宁波新芝生物科技股份有限公司；IS-RDV1/IS-RSV1 立式恒温振荡器，美国精骐有限公司；AS220.X2 分析天平，波兰RADWAG 公司；Thermo Fisher 全波长扫描式多功能读数仪，美国赛默飞世尔公司；L4-6K 台式低速离心机，湖南可成仪器设备有限公司；HWS24 电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料制备 委托当地面粉加工厂采用常规磨粉方法获得供试品种的商品麦麸。通过不同程度碾压进行麦麸分级制备，具体做法为：清除种子中的石子、泥块等杂质，快速清洗、烘干后，称取6份青稞倒入脱皮机，采用常规碾米工序，通过设定脱皮循环次数得到不同的脱皮率，出料口收集并称量青稞麦麸，计算脱皮率（%）=（青稞麸皮质量/青稞质量）×100。采用组织研磨器粉碎麦麸，过80目筛，备用。

1.2.2 绘制GABA 标准曲线 准确称取GABA标准品100 mg，用蒸馏水溶解并定容到100 mL，配制成1 mg/mL 的标准液。准确吸取0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mL 的1 mg/mL 的GABA 标准液于带盖的10 mL 离心管中，分别加入蒸馏水1，0.95，0.90，0.85，0.80，0.75 mL，得到不同浓度的GABA标准溶液。

采用Berthelot 比色法[24]对不同浓度的标准GABA 溶液进行处理，依次加入0.2 mol/L（pH 9.0）硼酸盐缓冲液0.6 mL，5%苯酚溶液2 mL，7%次氯酸钠溶液1 mL 混匀后，立即放入沸水浴加热13 min，冰浴冷却5 min，最后加入60%乙醇2 mL摇匀，然后在波长645 nm 处测定溶液的吸光度。以吸光度为横坐标，GABA 浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 GABA 产量及GAD 酶活力测定 GABA富集参考Jin 等[21]的方法，略有改动。具体操作步骤为：按照140∶1（g/L）的料液比，在180 r/min，30℃条件下振荡培养8 h。反应结束后3 800×g 离心15 min，取上清液1 mL 测定GABA 含量。GABA测量方法同1.2.2 节。利用绘制的标准曲线计算样品GABA 含量。

GAD 酶活力测定参考吕莹果[25]的方法，略有改动。具体操作步骤为：称取1 g 麦麸到三角瓶中，加入质量浓度为10 g/L 的谷氨酸钠底物溶液40 mL，在pH 5.7，40 ℃反应2 h，90 ℃加热5 min灭酶活，3 800×g 离心5 min，取上清测定产物GABA 含量，GABA 测量方法同1.2.2 节。以每30 min生成1 μmol 的GABA 作为一个酶活力单位。

1.2.4 GABA 合成工艺的单因素实验及正交试验分别考察pH 值（5.7，7）、料液比（60∶1，80∶1，100∶1，120∶1，140∶1，g/L）、反应时间（4，8，12，16，20 h）、反应温度（25，30，35，40，45 ℃）、磷酸吡哆醛浓度（0，10，20，30 μmol/L）、谷氨酸钠浓度（0，3，6，8，10 mmol/L）对青稞麸皮制备GABA 的影响。根据单因素实验结果，设计正交试验。试验因素与水平见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the test

1.3 数据处理方法

试验设置3 次重复。采用软件SPSS 25.0 进行显著性检验及方差分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

图1 为绘制的GABA 标准曲线，在波长645 nm 处的吸光值与GABA 质量浓度具有良好的线性关系：y=0.0955x-0.00009，回归系数R2=0.9994，RSD=1.8%，可以作为后续计算样品GABA 含量的参照标准曲线。

图1 GABA 标准曲线Fig.1 The standard curve of GABA content

2.2 青稞麦麸GAD 活性及GABA 产量分析

青稞属于高蛋白、低脂作物，其籽粒谷氨酸含量明显高于其它氨基酸组分[26]，基于前期对不同青稞品种籽粒GABA 含量的鉴定，选择15 个品种的商品麦麸进行GABA 富集的比较试验。从图2可以看出，利用不同青稞品种富集的GABA 产量存在显著差异，GABA 平均产量为5.29 mmol/L，变化范围为4.10～7.27 mmol/L，其中ZJ5 的GABA 生成量最高为7.27 mmol/L。GAD 是GABA 代谢通路中的限速酶，进一步分析发现，品种间GAD 酶活水平差异显著，GAD 酶活力平均为6.18 U，变化范围为4.33～9.91 U，且不同品种GABA 生成量与GAD 活性呈极显著正相关（r=0.988），表明品种间内源GAD 酶活性差异可能是GABA 产量不同的主要原因。因此，选择品种ZJ5 的商品麦麸作为GABA 富集方法优化的原料。

图2 不同青稞品种富集的GABA 产量及GAD 酶活力Fig.2 GABA yield and GAD activity of different highland barley varieties

2.3 利用青稞麸皮富集GABA 的单因素实验

2.3.1 pH 值对GABA 产量的影响 有研究表明麦麸GAD 酶活的最佳pH 值为5.7[25]，故而分别以蒸馏水和pH 5.7 的磷酸缓冲液作为浸泡溶液，比较其对GABA 产量的影响，GABA 富集方法同1.2.3 节。如图3 所示，不同浸泡液转化生成的GABA产量存在差异，在pH 5.7 的磷酸缓冲液条件下，2个青稞品种GABA 产量虽均高于以蒸馏水为介质的GABA 产量，但差异未达到显著水平。为减少生产过程中的化学物质成分，建立安全的GABA 制备方法，后续试验均以蒸馏水为反应溶液介质。

图3 pH 对GABA 产量的影响Fig.3 Effect of pH on GABA yield

2.3.2 料液比对GABA 产量的影响 分别按照60∶1，80∶1，100∶1，120∶1，140∶1（g/L）的料液比，准确称取6，8，10，12，14 g 麦麸加入到含有100 mL蒸馏水的三角瓶中，在180 r/min，30 ℃条件下振荡培养8 h，3 800×g 离心15 min，取上清液1 mL 测定GABA 含量。由图4 可知，GABA 产量随着料液比的升高而增加，在料液比为140 ∶1（g/L）的情况下，GABA 的产量最高，可达到7.30 mmol/L。继续增加料液比，反应搅拌困难，因此确定最适宜的料液比为140∶1（g/L）。

图4 料液比对GABA 产量的影响Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on GABA yield

2.3.3 反应时间对GABA 产量的影响 按照140∶1（g/L）的料液比称取14 g 麦麸，加入含有10 mmol/L 谷氨酸钠的100 mL 水溶液，在180 r/min，30 ℃条件下分别振荡培养4，8，12，16，20 h，3 800×g 离心15 min，取上清液测定GABA 含量。由图5 可以看出，4～8 h 是GABA 生成缓慢增长期，8～12 h 为GABA 的快速增长期，12 h 之后GABA 的合成趋于平稳。

图5 反应时间对GABA 产量的影响Fig.5 Effects of reaction time on GABA yield

2.3.4 反应温度对GABA 产量的影响 按照140∶1（g/L）料液比称取14 g 麦麸，加入含有10 mmol/L谷氨酸钠的100 mL 水溶液，分别在温度25，30，35，40，45 ℃，180 r/min 条件下振荡培养12 h，3 800×g 离心15 min，取上清液测定GABA 含量。从图6 可以看出，当反应温度在25～45 ℃时，GABA 的生成量呈先升高后降低的趋势，当反应温度为35 ℃时，GABA 的生成量最高，随后开始下降。

图6 反应温度对GABA 产量的影响Fig.6 Effects of reaction temperature on GABA yield

2.3.5 PLP 浓度对GABA 产量的影响 PLP 是维生素B6的活性形式，作为辅酶参与GABA 生物合成的谷氨酸脱羧反应。按照140∶1（g/L）料液比称取14 g 麦麸，分别加入含有0，10，20，30 μmol/L PLP 及10 mmol/L 谷氨酸钠的100 mL 水溶液。在180 r/min，30 ℃条件下振荡培养12 h，3 800×g 离心15 min，取上清液1 mL 测定GABA 含量。由图7 可以看出，在0～30 μmol/L PLP 浓度范围，GABA的生成量持续升高，当添加量大于20 μmol/L 时，GABA 的生成量增加趋于平缓。

图7 磷酸吡哆醛添加量对GABA 产量的影响Fig.7 Effect of the amount of pyridoxal 5'-phosphate on GABA yield

2.3.6 谷氨酸钠浓度对GABA 产量的影响 按照140∶1（g/L）料液比称取14 g 麦麸，分别加入含有0，3，6，8，10 mmol/L 谷氨酸钠以及10 μmol/L PLP的100 mL 水溶液。在180 r/min，30 ℃条件下振荡培养12 h，3 800×g 离心15 min，取上清液1 mL 测定GABA 的浓度。由图8 可以看出，在0～10 mmol/L 的谷氨酸钠添加量范围内，GABA 的生成量持续上升，在添加量为8 mmol/L 时，GABA 的生成量最高为14.01 mmol/L。当谷氨酸钠添加量大于8 mmol/L 后，GABA 的生成量开始下降。因此，后续优化试验谷氨酸钠的添加量为8 mmol/L。

图8 谷氨酸钠添加量对GABA 产量的影响Fig.8 Effects of the amount of sodium glutamate on GABA yield

2.4 青稞麦麸GABA 富集工艺优化的正交试验及验证

根据单因素实验结果，将料液比确定为140∶1（g/L），谷氨酸钠添加量为8 mmol/L，采用L9（33）正交试验对反应时间、反应温度、PLP 浓度3 个因素进一步优化。由表2 和表3 可知，3 个试验因素的极差（r）大小依次为rA＞rB＞rC，反应时间对GABA产量的影响最大，其次是反应温度和PLP 添加量。方差分析表明，反应时间、反应温度、PLP 添加量对GABA 产量的影响极显著（P＜0.01），根据各因素水平组合得到的GABA 含量结果显示，A2B2C3为最优组合，即在时间12 h，温度35 ℃，PLP 初始浓度18 μmol/L 的反应条件下，转化生成的GABA产量最高。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交试验方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

为验证优化工艺条件，按140∶1（g/L）的料液比，加入含有8 mmol/L 的谷氨酸钠以及18 μmol/L的磷酸吡哆醛水溶液，设置反应温度为35 ℃，反应12 h，3 次重复试验测得的GABA 生成量分别为15.07，15.13，15.16 mmol/L，平均含量为15.12 mmol/L，与正交试验结果相近，说明该工艺条件稳定可靠。

2.5 不同脱皮率对青稞麦麸制备GABA 的影响

胚芽和麦麸是籽粒GABA 合成的主要部位，为进一步调查麸皮脱皮率对GABA 产量的影响，通过不同碾磨程度的麸皮分级制备方法共获得7个试验组的青稞麦麸，脱皮率分别为0%（完整籽粒），4.23%，6.43%，13.62%（商品麦麸），23.78%，30.44%，34.27%。采用前述优化工艺条件富集制备GABA。

由表4 可以看出，随着青稞脱皮率的增加，麦麸富集的GABA 含量显著下降，当脱皮率＞23.78%时，籽粒外皮全部脱离，GABA 含量趋于稳定。同样，随着脱皮率的增加，对应的青稞米GABA 含量不断降低，在脱皮率为4.23%～6.43%范围时，差异不显著。因此，在前述优化工艺合成条件下，利用脱皮率为4.23%～6.43%的麦麸富集制得的GABA含量较高（17.27～19.57 mmol/L），明显高于商品麦麸富集的GABA 含量15.12 mmol/L。本试验利用青稞麦麸富集的GABA 含量最高可达19.57 mmol/L，相当于麸皮中GABA 含量为14.41 mg/g，显著高于前人报道的裸大麦富集GABA 产量7.56 mg/g[22]，也极显著高于米糠和小麦富集的GABA产量5.02 mg/g 和3.21 mg/g[21，27]。

表4 麦麸脱皮率对GABA 产量的影响Table 4 Effect of peeling rate of bran on GABA yield

为了测量添加底物谷氨酸钠的转化率，对试验组2 和3 设置了无底物添加的对照组，其余工艺条件相同。计算转化率（%）=（添加底物处理组GABA 量-未添加底物对照组GABA 量）/底物添加量×100。测量得到脱皮率分别为4.23%和6.43%麦麸的对照组GABA 产量分别为11.78 mmol/L 和9.44 mmol/L，相应的底物转化率分别为97.38%和97.88%，表明在上述工艺条件下，底物谷氨酸钠转化为GABA 的效率极高，残留量低。

3 结论

青稞是青藏高原特色主粮作物，富含多种营养成分及功能活性物质。本研究发现，利用不同青稞品种麦麸为原料富集的GABA 产量差异较大，且与品种内源GAD 活性密切相关，其中品种ZJ5的GABA 产量最高。在pH 值、料液比、外源谷氨酸钠和PLP 浓度、反应温度和时间的单因素实验基础上，通过反应时间、温度和PLP 浓度的三因素三水平正交试验，得到GABA 富集的优化工艺条件。不同脱皮率的麸皮分级制备对GABA 产量影响显著，在不使用缓冲溶液，安全添加谷氨酸钠和PLP 的条件下，青稞麦麸GABA 安全高效的制备技术为：麸皮脱皮率为4.23%～6.43%，料液比为140∶1（g/L），反应时间为12 h，反应温度为35 ℃，分别添加浓度为8 mmol/L 的谷氨酸钠和18 μmol/L 的PLP，获得的GABA 最高产量为19.57 mmol/L（14.41 mg/g），外源底物转化率高于97%。该工艺技术为食物源高含量GABA 绿色制备和青稞副产物高值化利用提供了理论和技术支持，后续将在中试或更大规模条件下继续优化GABA 青稞麦麸富集的工艺条件。