张家口地区鸡柔嫩艾美耳球虫分离鉴定及对磺胺氯吡嗪钠和地克珠利的耐药性分析

王 鹏，郭 兵，王海凤，方素芳，顾小龙，关 琛，刘康雅，崔 平*

（ 1． 河北北方学院动物科技学院，河北 张家口 075000 ；2． 张家口市畜牧技术推广站，河北 张家口 075000 ； 3． 中粮饲料（唐山）有限公司，河北 唐山 064100 ）

鸡球虫病是多种艾美耳属球虫寄生在鸡肠道上皮细胞而引起的一种原虫病[1]，疫病流行普遍，可感染不同日龄的鸡，对鸡群造成不同程度的影响，严重危害养禽产业发展[2-3]。在世界公认的鸡球虫有效种中以柔嫩艾美耳球虫与毒害艾美耳球虫致病性最强[4]。目前，大多养殖户仍采用化学合成药物对鸡球虫病进行预防、治疗，导致球虫的耐药性越来越强[5-6]。本研究从张家口某养鸡场的粪样和患病雏鸡盲肠内容物中分离到柔嫩艾美耳球虫，并通过形态学和分子生物学方法进行鉴定，选取常用抗球虫药物进行耐药性检测，旨在摸清张家口地区鸡球虫的耐药性情况，并为鸡场合理选择抗球虫药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集与处理

从张家口某养鸡场取新鲜粪便或病死鸡盲肠内容物，通过饱和盐水漂浮法分离球虫卵囊，经80目和100目铜网过滤，收集滤液置至500 mL锥形瓶中，加2.5%重铬酸钾溶液，浓度为每毫升1×106个卵囊，置于27～28 ℃恒温摇床培养3 d，摇床转速100～120 r/min，当孢子化卵囊达到85%以上停止孵化，于4 ℃保存。

1.2 形态学鉴定

将孢子化的卵囊悬液置于载玻片上镜检，参考文献[7-8]中描述的鸡球虫孢子化卵囊的形态结构，对样品进行虫种的形态学鉴定。

1.3 分子生物学鉴定

用纯化孢子化卵囊，按照基因组DNA 提取试剂盒说明分别对分离得到的孢子化卵囊提取基因组DNA，以GenBank上KY117231.1、KY117230.1、KY117229.1基因序列为参考，选出柔嫩艾美耳球虫特异性保守区域，采用Premier 5.0 设计引物。引物序列为上游引物:5'-TCCTACATGCAACTGGAGCA-3'，下游引物:5'-CCCAGTGGGTTACTAGATCCG-3'，片段大小379 bp。由上海基康生物科技有限公司合成。

反应体系（25 μL）:PCR Mix 12 μL、上游引物（50 pmoL） 1μL、下游引物（50 pmoL) 1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 10 μL。

PCR 反应条件:94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存，电泳观察结果。

1.4 耐药性检测-鸡体试验法[9]

1.4.1 试验药物与给药途径

按每150 mL 地克珠利溶液添加300 kg 水，磺胺氯吡嗪钠可溶性粉按每50 g添加160 kg水，两种药物均通过饮水给药。

1.4.2 试验设计

选取25日龄且体重接近的黄羽肉鸡132只，随机分为6组，其中4个组是攻毒用药组，包括地克珠利组A、地克珠利组B、磺胺氯吡嗪钠组A、磺胺氯吡嗪钠组B，另外2组分别是攻毒不给药组（阳性对照组）、不攻毒不给药组（阴性对照组）。4 个攻毒用药组和1 个攻毒不给药组中的试验鸡于第26 日龄分别经嗉囊接种1×104个柔嫩艾美耳球虫分离株孢子化卵囊。攻毒前1 d 对各药物试验组进行用药，连续用药8 d。

1.4.3 临床观察和卵囊计数

攻毒后每日观察各组试验鸡的精神状态、采食、饮水、粪便等情况，当发现有血便排出时进行血便记分。试验期间，若有鸡死亡需及时解剖并观察病变处，以便确认是否是由鸡球虫病引起的死亡，同时记录死亡鸡个数。

攻毒后第6 d开始，每天收集各感染组鸡粪便，采用麦克马斯特氏法进行卵囊计数；攻读后第8 d，所有试验组鸡先称重后进行屠宰、解剖，观察盲肠病变并进行病变记分。当两侧盲肠病变结果不一致时，按较严重的一侧为准，凡由于盲肠球虫病导致死亡的鸡记4分。同时，取盲肠内容物及肠黏膜，采用胃蛋白酶消化后收集卵囊，并进行卵囊计数。将肠道中的卵囊数与同一感染组第6～8 d粪便中的卵囊数相加，即为该组的卵囊总产量，计算该组每只鸡的平均卵囊数。

1.5 耐药指标与判定标准

各感染给药组耐药指标的测定与判定方法见表1。

表1 鸡球虫常用的耐药指标与判定方法Tab.1 Commonly used drug resistance indexes and judging methodsof chicken coccidiosis

各指标计算方法参考以下公式:

盲肠内容物的卵囊值采用角田清[10]的方法进行计算，换算方法见表2。

表2 盲肠内容物的卵囊值Tab.2 Oocyst values of cecal content

依据POAA、RLS、ROP和ACI等4个指标中存在阳性耐药的量，以此确定柔嫩艾美耳球虫张家口株对地克珠利与磺胺氯吡嗪钠的耐药程度:4 个指标均为阴性判定为无耐药性；1个指标呈阳性判定为轻度耐药；2个指标呈阳性判定为中度耐药；3或4个指标呈阳性则判定为完全耐药。

2 结果与分析

2.1 鸡球虫卵囊的形态学观察（见图1）

图1 鸡球虫卵囊的形态学观察Fig.1 Morphological observation of chicken coccidiosis oocysts

由图1 可知，采用饱和盐水漂浮法收集粪便中和病死鸡盲肠中的卵囊，培养至孢子化，镜检发现视野中卵囊呈卵圆形、椭圆形或近似圆形的球虫。

2.2 鸡球虫的PCR鉴定结果（见图2）

图2 分离虫株PCR鉴定结果Fig.2 Insect strain isolated PCR identification results

由图2 可知，提取从张家口某鸡场分离获得的鸡球虫DNA，利用柔嫩艾美耳球虫特异性引物进行PCR扩增得到约379 bp 的目的条带，无其他球虫种的条带出现，与预期结果一致，表明试验分离的球虫为柔嫩艾美耳球虫。

2.3 分离虫株耐药性分析

2.3.1 临床观察结果

整个试验期内，除阳性对照组出现明显的柔嫩艾美耳球虫引起的症状以及死亡外，其他攻毒给药组与阴性对照组的鸡生长状态均正常。

2.3.2 不同药物对感染球虫雏鸡增重及POAA 的影响（见表3）

表3 不同药物对感染球虫雏鸡增重及POAA的影响Tab.3 Effects of different drugs on weight gain and POAA of chicks infected with coccidia

由表3 可知，阴性对照组鸡的增重为669.3 g，高于攻毒给药组与阳性对照组；磺胺氯吡嗪钠组增重效果比地克珠利组好。磺胺氯吡嗪钠组的POAA均大于50%，呈耐药阴性；地克珠利组POAA均小于50%，为耐药阳性。

2.3.3 不同药物对感染球虫雏鸡盲肠病变记分及RLS 的影响（见表4）

表4 不同药物对感染球虫雏鸡盲肠病变记分及RLS的影响Tab.4 Effects of different drugs on cecal lesion score and RLS of chicks infected with coccidia

由表4可知，排血便数最多的是阳性对照组，血便记分均为3.40分，有3只鸡死亡；排血便数最少的是磺胺氯吡嗪钠给药组，血便记分为0，无死亡情况。磺胺氯吡嗪钠组RLS 均为61.76%，呈耐药阴性。地克珠利组排血便数较多，血便记分为2.65、2.68分，每组死亡2只鸡，RLS分别为22.06%和21.18%，均小于50%，呈耐药阳性。整个试验期间阴性对照组鸡均正常，盲肠未见异常变化，试验结束时粪检未见卵囊。

2.3.4 不同药物对感染球虫雏鸡盲肠卵囊产量的影响（见表5）

表5 不同药物对感染球虫雏鸡盲肠卵囊产量的影响Tab.5 Effects of different drugs on cecal oocyst production of chicks infected with coccidia

由表5可知，阴性对照组雏鸡的盲肠内均无卵囊，阳性对照组卵囊数量最多，两个地克珠利组的ROP 值均高于50%，表明张家口分离株柔嫩艾美耳球虫对地克珠利具有耐药性。两个磺胺氯吡嗪钠组的ROP值均低于15%，均为不耐药即药物敏感。

2.3.5 不同药物对感染球虫雏鸡ACI的影响（见表6）

表6 不同药物对感染球虫雏鸡ACI的影响Tab.6 Effects of different drugs on ACI in chicks infected with coccidia

ACI 是根据存活率、相对增重率、病变值等多项参数综合判定球虫耐药性的药效指标。

由表6 可知，磺胺氯吡嗪钠组1 的ACI 值最高，达到159.79，呈耐药阴性，属于抗球虫高效水平；地克珠利组ACI 值分别为148.70 和134.70，均低于160，呈耐药阳性。结果表明，张家口柔嫩艾美耳球虫分离株对地克珠利耐药，对磺胺氯吡嗪钠部分敏感。

2.3.6 分离虫株对磺胺氯吡嗪钠和地克珠利耐药性的综合判定结果（见表7）

表7 分离虫株对磺胺氯吡嗪钠和地克珠利耐药性的综合判定结果Tab.7 Results of comprehensive evaluation of resistance to sulfameclopyrazine sodium and diclazuril in isolated strains

由表7可知，综合POAA、RLS、ROP和ACI等4项指标判定，分离虫株对磺胺氯吡嗪钠对地克珠利完全耐药，对磺胺氯吡嗪钠表现轻度耐药。

3 讨论

鸡球虫虫种之间仅依靠形态特征及其病理变化进行区分很难完成，所以需要结合分子生物学方法对球虫种类进行鉴定[11-12]。本试验从发病雏鸡的盲肠内容物中分离到球虫，利用艾美耳属球虫特异性引物对已分离的球虫进行PCR 检测以鉴定虫种。PCR 鉴定结果显示扩增出约379 bp 的目的条带，无其他球虫种的条带出现，与预期结果一致，确定分离的球虫为柔嫩艾美耳球虫。本鉴定方法适用于规模化养殖场的检测，便于在现场监控球虫病的流行情况，为制定球虫病的防治措施提供了一定参考。

目前，使用抗球虫药物是控制球虫病的主要手段，但球虫耐药是一个动态过程[13-14]。本研究选用鸡体试验方法，检测了张家口地区分离到的柔嫩艾美耳球虫对抗球虫药物磺胺氯吡嗪钠和地克珠利的耐药性，以RLS、POAA、ROP 和ACI等4项指标进行球虫耐药性评价。总体来看，张家口地区鸡球虫对本试验所选取的磺胺氯吡嗪钠和地克珠利两种药物表现不同程度的耐药，分离虫株对磺胺氯吡嗪钠轻度耐药，对地克珠利完全耐药。鉴于这一检测结果，建议该地区停用地克珠利，使用磺胺氯吡嗪钠。但产蛋期禁用磺胺氯吡嗪钠，且肉鸡需要保证休药期。所以，蛋鸡在产蛋期必须选用其他抗球虫药，同时定期进行耐药性的监测。使用抗球虫药物时应进行交替用药或联合用药，以延长药物的使用寿命，同时还必须做好饲养管理等综合性防治措施[15]。

4 结论

由于养鸡业的发展以及抗球虫药物长期使用，张家口地区鸡球虫均已出现不同程度的耐药性。本研究虽然能够为张家口地区的鸡球虫病防治提供一些参考，但若要彻底解决球虫对当地养鸡业的阻碍还需从多方面努力。养鸡企业在搞好日常管理的同时，有条件的鸡场最好进行球虫耐药性测定，根据测定结果制定适合本场的预防和治疗用药方案，将球虫病的威胁降至最低，以减少经济损失、提高养殖效益。