基于网络药理学和分子对接预测覆盆子治疗绝经后骨质疏松的作用机制

何芳，余学英，李思齐

十堰市太和医院 湖北医药学院附属医院 药学部，湖北 十堰 442000

绝经后骨质疏松症是由于绝经后雌激素缺乏，加之遗传、营养等因素引起的骨退行性慢性代谢性疾病，属于原发性骨质疏松的一种[1]。50～79 岁女性绝经后骨质疏松症发病率为67.3%[2]，随之而来的高医疗保健费用、身体残疾、生活质量降低等问题日益突出。且随年龄的增长，该病发病率越高，故骨质疏松症及其并发症的预防成为一个主要的公共卫生问题。

覆盆子首载于《神农百草经》中，为蔷薇科植物华东覆盆子Rubus chingiiHu 的干燥果实，具有益肾固精缩尿、养肝明目功效，亦是营养丰富的黄金水果，是一种药食同源的药材。覆盆子含有黄酮类（山柰酚-3-O-芸香糖苷、覆盆子素A、覆盆子素B、椴树苷等）、酚酸类（鞣花酸、抗坏血酸、没食子酸等）、香豆素类（七叶内酯等）等成分。覆盆子具有抗骨质疏松、抗衰老[3]、抗癌[4]、抗炎、降糖以及调血脂等活性[5-6]。随着人们养生观念的转化，抗骨质疏松疗效被现代学者关注较多。如覆盆子水煎液高、中、低剂量组（6、3、1.5 g/kg）可显著降低血清中骨钙素水平，增高骨力学强度与骨密度，改善骨质中的钙流失，升高血Ca2+水平、降低血P 水平，使血中Ca2+与P 保持一个恒定的比值，增强骨密度[7]；覆盆子中的覆盆子素A 和覆盆子素B 能抑制破骨细胞活性[8]。覆盆子复方骨痿Ⅰ号方[9]、益肾复原方[10]、龟鹿补肾胶囊[11]等均可用于骨质疏松症的治疗。但覆盆子对绝经后骨质疏松治疗的作用机制，本研究拟采用网络药理学和分子对接的方法对覆盆子治疗骨质疏松的成分、靶点、通路及作用机制进行预测，以期更好的开发利用覆盆子。

1 资料与方法

1.1 覆盆子活性成分及成分靶点的筛选

在TCMSP 数据库中以“覆盆子”为关键词进行搜索，并以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 作为筛选标准，获取符合条件的活性成分。同时，查询中国知网、万方、PubMed 等数据库，补充覆盆子治疗骨质疏松的成分。使用ChemBioDraw 软件绘制活性成分结构，保存为mol2格式文件，导入到PharmMapper 平台，进行靶点的反向预测，获取成分靶点。并取Z-score 较大的50个靶点作为覆盆子活性成分的潜在作用靶点。

1.2 绝经后骨质疏松相关靶点的收集

在GEO数据库以“postmenopausal osteoporosis”为关键词，物种为“Homo sapiens”，获取相关基因矩阵数据文件。并以P＜0.01 和|log2FC|＞1.0 筛选差异基因，绘制火山图。依据 GeneCards、DisGeNET、OMIM、TTD 数据库，以“postmenopausal osteoporosis”为关键词进行检索，筛选条件为“Homo sapiens”，Relevance score≥10（GeneCards）、GDA score≥0.3（DisGeNET）[12]，获得绝经后骨质疏松症相关的靶点信息。将GEO 数据库差异基因与绝经后骨质疏松症相关的靶点信息合并去重，即为绝经后骨质疏松症疾病靶点。

1.3 蛋白相互作用（PPI）网络图的构建

利用Cytoscape 3.7.2 和STRING 11.5 软件，对上述收集到的活性成分与1.2 项下交集部分的靶点进行可视化网络图和靶点相互联系的网络图的构建，获取主要活性成分和核心基因靶点。

1.4 基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

利用R Studio 软件，以P＜0.05 为标准，进行GO 富集分析和KEGG 代谢通路分析，绘制相应的网络图。

1.5 分子对接验证

从TCMSP 数据库、PubChem 数据库以及PDB数据库获得覆盆子活性成分的三维结构信息、靶蛋白的三维结构；并利用AutodockTools 1.5.6 软件对小分子和靶蛋白进行分子对接，采用pymol 软件对对接结果进行验证。

2 结果

2.1 覆盆子的活性成分

以OB≥30%，DL≥0.18 为筛选条件，从TCMSP 中筛选出符合条件的有7 个活性成分，根据文献报道[8,13-22]查找出9 个覆盆子有效成分，最终得到覆盆子的潜在活性成分16 个，见表1。

表1 覆盆子活性成分Table 1 Active ingredients in Rubus idaeus

2.2 靶点的收集

GEO 筛选数据集中，选择GSE230665 作为研究数据集，该数据集包含12 例绝经后骨质疏松症及3 例健康志愿者，利用GEO 2R 工具筛选、整理后得差异基因7 710 个，其中上调基因7 690 个，下调基因20 个，见图1。从TCMSP 数据库中中检索到237 个覆盆子成分相关的靶点，从GeneCards、DisGeNET、OMIM、TTD 数据库中分别检索到绝经后骨质疏松症相关靶点1 225、308、45、36 个。删除相同靶点，获得绝经后骨质疏松症靶点1 336 个。将绝经后骨质疏松症靶点与活性成分靶点取交集，获得覆盆子治疗绝经后骨质疏松症潜在靶点63 个。

图1 差异基因火山图Fig.1 Differential gene volcano map

2.3 PPI 网络图制作及分析

利用Cytoscape 3.6.0 软件，构建了覆盆子活性成分与靶点的可视化网络图，见图2。从结果可知，活性成分的平均degree 值是12，其中β-谷甾醇、熊果酸、覆盆子素A、谷甾醇、覆盆子素B、鞣花酸、齐墩果酸的degree 值均大于12，分别为20、18、17、15、15、14、14，推测这7 个成分是与绝经后骨质疏松症靶点作用较大的活性成分。

图2 活性成分与靶点的网络图Fig.2 Network diagram of active ingredients and targets

利用STRING 11.0 软件，绘制77 个靶点的PPI网络，见图3。从靶点PPI 网络图及数据结果可知，绝经后骨质疏松症靶点的平均degree 值是14，白蛋白（ALB）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、雌激素受体α（ESR1）、Harvey 肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、有丝分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）degree 值均大于16，推测这9 个靶点可能是覆盆子对绝经后骨质疏松症治疗发挥作用较大的靶点。

图3 靶点PPI 网络图Fig.3 Target PPI network diagram

2.4 GO 和KEGG 富集分析

利用R Studio 软件中CludterProfiler 文件包，以P＜0.05 作为筛选条件，对收集的主要靶点进行GO 分析，发现生物学过程（BP）有999 个条目，细胞组分（CC）有21 个条目，分子功能（MF）有78 个条目。选取了较显著的前15 个条目进行了GO富集分析，发现BP 主要富集在激素介导的信号通路、类固醇激素介导的信号通路、对类固醇激素的反应、细胞对类固醇激素刺激的反应、细胞内受体信号通路等；CC 主要富集在等离子膜筏（plasma membrane raft）、膜筏（membrane raft）、膜微畴（membrane microdomain）、膜区域（membrane region）等；MF 主要富集在类固醇激素受体活性（steroid hormone receptor activity）、核受体活性（nuclear receptor activity）、转录因子活性（transcription factor activity）、类固醇结合（steroid binding）、激素受体结合（hormone receptor binding）等，见图4。

图4 GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

利用R Studio 软件中CludterProfiler 文件包，对主要靶点进行KEGG 通路富集分析，得到108 条通路。以P＜0.05 为筛选条件，选取了前20 个degree值较高的通路进行了KEGG 代谢通路分析，主要有化学致癌–受体激活、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）–蛋白激酶B（Akt）信号通路信号通路、脂质与动脉粥样硬化、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、癌症中的蛋白多糖等代谢通路，见图5。

图5 KEGG 通路分析Fig.5 KEGG channel analysis

2.5 分子对接结果

选取degree 值靠前的β-谷甾醇（C3）、熊果酸（C11）、覆盆子素A（C15）、谷甾醇（C4）、覆盆子素B（C16）、鞣花酸（C1）、齐墩果酸（C10）7 种成分与degree 值较大的ALB、SRC、CASP3、MMP9、ESR1、HRAS、PPARG、MAPK1、MAPK14 进行对接，对接结果见表2，热图见图6。从对接结果可知，结合能位于−6.9～−12.4 kcal/mol（1 cal＝4.4 J），表示成分与靶点的结合能力较强。结合能较强的部分受体与配体的对接模式见图7，对接结果表明受体与配体结合比较牢固。

图6 分子对接结合能相关热图Fig.6 Molecular docking binding energy-related heat map

图7 分子对接模式图Fig.7 Molecular docking model diagram

表2 成分与靶点对接的结合能Table 2 Binding energy of components docking with targets

3 讨论

本研究通过网络药理学的方法，对覆盆子中治疗绝经后骨质疏松症的活性成分、靶点、通路等进行了预测。研究发现，覆盆子治疗绝经后骨质疏松症的主要成分可能是β-谷甾醇、熊果酸、覆盆子素A、谷甾醇、覆盆子素B、鞣花酸、齐墩果酸等。研究发现覆盆子素A、覆盆子素B 等具有很强的抑制破骨细胞分化和骨吸收的活性。β-谷甾醇可调节成骨细胞保护因子与破骨分化因子的平衡，促进骨组织的修复[23]；谷甾醇、β-谷甾醇具有雌激素样作用，提高成骨细胞护骨素（OPG）与破骨细胞分化因子（ODF）的比值[24]，从而促进成骨作用。张洪然等[25]将大鼠酒精性骨质疏松模型ig 给予熊果酸研究发现，干预8 周后，骨损伤明显改善，骨小梁变粗，且可以连接成网，脂多糖降低，Ⅰ型胶原羧基端交联肽降低，明显改善骨质疏松的状态。鞣花酸一方面通过抑制破骨前体细胞分化而抑制破骨代谢[26]，另一方面通过促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）中Runt相关转录因子2（RUNX2）、碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）以及β 连环蛋白（β-catenin）表达，抑制其成脂分化，促进BMSCs 的成骨分化，其机制可能与激活Wnt/β-catenin 信号通路有关[27]。

研究中发现ALB、SRC、CASP3、MMP-9、ESR1、HRAS、PPARG、MAPK1、MAPK14 9 个靶点的degree 值较高，推测其可能在绝经后骨质疏松症治疗中发挥重要作用。MAPK1、MAPK9、MAPK14 是MAPK 家族的重要成员[28]，主要作用于MAPK 信号通路，促进与骨形成相关的信号蛋白的合成与释放[29]，参与骨骼的发育、重塑和修复。CASP3 是绝经后骨质疏松的作用靶点，一般骨质疏松患者的CASP3 增加，与骨质疏松患者成骨细胞的凋亡有关[30]。而KEGG 过程主要集中在化学致癌–受体激活、PI3K-Akt 信号通路、脂质与动脉粥样硬化、MAPK 信号通路、癌症中的蛋白多糖等。PI3K-Akt 信号通路是一种重要通路，主要参与炎症反应、细胞增殖凋亡及骨代谢异常，研究发现激活PI3K-Akt 信号通路，可以增加骨小梁的不规则性，使破骨细胞增多[31]。作用于脂质与动脉粥样硬化通路，可引起氧化低密度脂蛋白转导异常，从而引起成骨细胞的异常生长[32]。且将主要活性成分与关键靶点进行对接，结果显示结合能位于−6.9～−12.4 kcal/mol，对接较为牢固，表明本研究对覆盆子治疗绝经后骨质疏松的预测结果较为可靠。

综上可知，覆盆子可通过β-谷甾醇、熊果酸、覆盆子素A、谷甾醇、覆盆子素B、鞣花酸、齐墩果酸等多个活性成分与ALB、SRC、CASP3、MMP9、ESR1、HRAS、PPARG、MAPK1、MAPK14 等多个靶点相结合，作用于多个通路而发挥治疗绝经后骨质疏松的作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突