甲、乙型流感病毒检测方法的研究进展

胡瑞，张艳亮，张娟

1.昆明医科大学第一附属医院医学检验科，云南昆明 650032；2.云南省检验医学重点实验室，云南昆明 650032；3.蒙自市中医医院检验科，云南蒙自 661199

流感（F1u）是由流感病毒（influenza virus）引起的急性发热性呼吸道传染病，主要经呼吸道飞沫传播，临床典型表现为突起畏寒、高热、头痛、全身酸痛、疲乏、食欲减退等，全身中毒症状明显，而呼吸道症状较轻。具有潜伏期短、传染性强、传播速度快、发病率高等特点，通常还会并发较为严重的肺炎，更甚者还会致使患者出现肾、心脏等重要器官的衰竭，严重者还会致死，对公共卫生及人们身心健康带来重大威胁。依据基质蛋白与核衣壳蛋白的同源性，一般将流感病毒分为3 种类型（甲、乙和丙）[1]。其中人类中最为流行的病毒主要为乙型流感病毒（influenza B virus, IB）和甲型流感病毒（influenza A virus, IA），而以上两种病毒归属为正粘病毒科（onhomyxoviridae），为8 节段、单股负链RNA 病毒[2]。作为引起数次世界范围较大流行的病毒，依据IA 表面的糖蛋白、神经氨酸酶（neuraminidase,NA）和血凝素（hemagglutinin, HA），可将IA 进一步化分为：H7N9、H3N2、H1N1、H5N1[3]。乙型流感病毒根据抗原特性和血凝素基因的核苷酸序列，可分为Yamagata 和Victoria 两大谱系，乙型流感病毒的感染性和传播能力较甲型弱且只感染人类，一般会引起局部流行。近年来世界各地都曾发生以甲型流感病毒或乙型流感病毒为主的流感流行[4]。因此，利用实验室诊断方法快速、准确鉴别流感病毒至关重要，实现早诊断、早隔离、早治疗。本文就目前常用的甲、乙型流感病毒病原学相关检验方法进行综述，旨在为临床提供快速准确的诊断依据。现综述如下。

1 病毒分离培养

作为国际上较为常用的筛选流感疫苗株以及对流感病毒进行监测的一种实验室方法，病毒分离培养法是目前流感监测研究中一种可靠的检测手段[5]。病毒分离培养法具有敏感性高且精确度高等优点，在一定条件下可获得更多、更全面的流感毒株信息情况，对后续了解流感病毒的耐药性以及指导临床制定科学有效的治疗方案都具有十分重要的意义[6]。但也有一定局限性，如对操作要求高且繁琐，细胞分离培养周期较长，实验必须在BSL-2级及以上实验室的生物安全柜内进行，存在一定安全隐患，不利于在流行期间做出快速诊断，故在基层医院中不建议进行临床推广应用。

2 免疫学方法

对于流感病毒的检测，免疫学方法属于一种相对成熟的病毒检测技术。常用的方法有胶体金法、免疫荧光法、流式细胞仪法、血清学检测方法等。

2.1 胶体金法

作为临床上较为普遍使用的一种标记技术，胶体金法是利用追踪标志物（胶体金）与抗原抗体进行结合，从而达到免疫标记的一种新型技术，具有独特的优点。近年已在各种生物医学研究中广泛使用。这也成为临床免疫学研究的重点及热点，受到临床医学科研界的广泛关注[7]。胶体金免疫标记技术是现今临床研究使用较多的一种检测流感病毒的手段。在国内外已上市的流感病毒检测产品中，流感抗原检测试剂检测的手段基本上都是依据快速免疫检测原理而进行的免疫层析以及免疫渗滤等方法[8]。胶体金法是一种快速简便的方法，可在15～30 min 内获得检测结果，具有不需特殊实验设备、可用肉眼判定、试剂保存方便、稳定性和重复性好等优点，对于人群现场快速初筛定性，及时监控感染人群防止继续传播具有很大的优势。当然其也有不足之处，如胶体金法定性试验检测准确度较低、假阳性率高、阴性不能排除病毒感染、难以进行质量控制等。

2.2 免疫荧光法

免疫荧光法主要是在荧光物质的帮助下对抗体进行标记，从而达到对抗原进行定位的目的，同时其进行标记的荧光色素对抗原抗体的活性没有任何影响，其在抗体上通过与对应的抗原进行结合后会显现出一种特异性的荧光反应。在李晓光等[9]的研究中对472 例患者采用免疫荧光法检测，对乙型/甲型流感进行单独或者联合检测，其检测的特异度以及灵敏度均相对较高。Diallo D 等[10]应用Sofia 免疫荧光法对238 例儿科急诊患儿进行甲、乙型流感病毒检测，结果为阳性组得到明确诊断，故住院率明显降低。免疫荧光法帮助患者机体内部组织中的病毒抗原与抗病毒抗体（标有荧光素）进行相应的结合，具有高度的特异性以及敏感性，对流感患者明确诊断，指导治疗，改善预后均有重要意义，是目前很多基层医院实验室流感病毒检测的主流方法[11]。但是该种方法的操作步骤相对复杂，且对结果进行判断时有较大主观性，因此假阳性的概率相对较高，无法满足临床检测所需要的高效、快速等要求。

2.3 流式细胞仪法

流式细胞仪法检测甲、乙型流感病毒抗原是运用待测抗原与荧光素标记抗体特异性反应，将悬浮细胞染色和流式细胞仪计数原理相结合。刘冬兰等[12]采用流式细胞仪及直接荧光素标记抗体以检测甲、乙型流测病毒抗原，针对157 份鼻咽拭子标本，两种检测方法的结果一致性较好。应用流式细胞仪法检测能够实现高通量检测，不仅结果准确可靠、操作简便，而且检测速度相对较快，其一般同时进行筛查和鉴定两项工作，并在2 h 内提供结果，故临床检测的应用价值相对较高。但需用专用仪器，标本陈旧、运输或保存不当等可致抗原降解出现假阴性结果。

2.4 血清学检测方法

人体内部一但感染病毒后，病毒就会在人的机体内产生对应的病毒特异性抗体，而且由于在患者感染流感病毒（甲型、乙型）后，潜伏期相对较短，故大多数情况下患者血清中的抗体都是在病程后或者结束期才得以被检测出，且对于急性期的患者血清，在其处于恢复阶段，其机体内部血清会造成某种类型的流感病毒的中和抗体滴度呈现出4 倍及以上升高的趋势，从而对患者是否感染了以上亚型的流感病毒进行确诊。而血清学的检测方法对甲、乙型流感病毒检验的特异度相对较高，同时该种检测方法在对疫情的监控、鉴别流感的分型等流行病学的相关研究以及对于疫苗的评估都拥有相对举足轻重的作用。但是在进行检测实验时，往往需要对患者急性期和恢复期的血液分别进行采集，且进行实验的周期相对较长，同时拥有较多的干扰因素，因此不建议作为早期对病毒进行快速诊断的方法。

3 病毒核酸检测方法

近几年，病毒核酸检测技术已被越来越广泛地应用于诊断病原体的检测中，对甲、乙型流感病毒核酸进行检测的技术，主要是通过在核酸扩增的帮助下对病毒进行检测，且其对于病毒检测以及诊断的特异性、灵敏度相较于其他检测方法更高。

3.1 聚合酶链反应

作为一种能够在体外扩增特定DNA 片段的分子生物学技术，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）具有敏感性、特异性高等优点，可在较短时间内对流感病毒进行检测，对早期诊断流感病毒感染具有较高价值[13]。目前，对甲、乙型流感病毒核酸进行检测的PCR 法，大多数采用实时荧光聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）法和常规逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）法。其中常规RT-PCR 能够对标本中的流感病毒核酸展开检验，此外，其还能够通过将扩增产物测序后，对序列进行分析，从而依据系统分析对病毒的对应亚型进行判断，但是常规RT-PCR 需要进行开放式电泳的相关步骤，因此容易对样本造成交叉污染。而实时荧光RT-PCR 通过将Taqman 与RT-PCR 技术进行结合，在荧光标记物的帮助下采用相对较为封闭的检测，同时还能够将样本中的病毒载量进行相关的定量分析[14]，通常情况下不用对PCR 的产物在整个进行检测的过程进行下一步的处理，所以该种检测的整体检测时间就相对较短，具有较高的检测效率，同时其假阳性的发生率以及检测中的感染率均相对较低；且其主要通过应用特异性探针的方法对非特异性扩增的情况进行检测，因此与常规RT-PCR 进行对比，该种方法拥有相对较为简单的操作过程，且特异度以及灵敏度均相对较强，还可达到高通量检测的目的[15]。该种方法是预防甲、乙型流感疫情暴发流行的关键环节，能够消减传染高峰、延缓传播速度。

3.2 恒温核酸扩增技术

恒温核酸扩增技术是利用各种酶、引物、核苷酸、模板核酸以及缓冲液的混合物在同一温度下温浴一定时间，让不同的酶与核酸进行反应，从而达到特定核酸片段的快速扩增目的。与传统的PCR核酸扩增相比，恒温核酸扩增不需要在不同温度之间的转换，只要保持酶反应的最佳温度即可。需要使用的设备比较简单，可以将检测成本大大降低，从而有效地提高现场检测的效率，缩短现场检测所需要的时间[16]。该检测方法的建立，对甲、乙型流感病毒的临床快速诊断和预防控制具有重要的意义，恒温核酸扩增技术在季节性高流行期间有望取代传统PCR 诊断技术[17]。目前检测甲、乙型流病毒较常用的恒温扩增法有重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）、依赖核酸序列扩增（nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）、环介导的等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）等。

3.2.1 LAMP 技术 LAMP 技术主要是对靶序列特异位置的引物、BstDNA 聚合酶及拥有的链置换活性进行识别，在等温条件时，其能够自动循环进行链置换核酸扩增反应，在反应期间，能够产生肉眼可见的白色沉淀。而该种检测的操作方法相对简单，且处于等温的环境中就能够发生核酸的扩增以及变性，无需其他仪器设备进行辅助，仅需要肉眼即可对检测结果进行判定；该种方法具有高效率且扩增快速的特点，不需要预先双链DNA 热变性，并且短时间内扩增指数可达109以上；该种方法具有较高的检测特异性，其对6～8 个靶序列区域设计的4～6条特异性引物，任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。RT-LAMP 技术是一步核酸扩增技术，采用LAMP 和逆转录酶进行病毒RNA 检测。与RT-PCR 一样，RT-LAMP 使用逆转录酶从RNA 制备互补DNA，并通过使用DNA 聚合酶进一步扩增。这在用RNA 基因组检测病毒方面非常有效。崔淑娟等[18]的研究中指出，在对甲型流感病毒的检测中，RT-LAMP 方法灵敏度较高（检测限下限：50 拷贝/ul），且对比该种方法与实时荧光PCR 检测后可发现，该种方法更适用于在现场或者基层进行相对较快的检测。但LAMP 技术只能定性，引物设计难度高，操作过程中极易受到污染而至假阳性结果。3.2.2 RPA 技术 作为一种较为新型的核酸等温扩增技术，RPA 技术是在链置换DNA 聚合酶、单链DNA结合蛋白（single strand DNA-binding protein, SSB）以及能结合寡核苷酸引物的重组酶的帮助下完成检测。以上各种酶的混合物需要在37℃的环境下才可进行反应。引物通过蛋白-DNA 复合物（重组酶与引物结合的产物）的帮助，可以对同源序列的位置进行确定，并于确定后生成链交换反应，并于以上物质生成的同时启动DNA 的合成，并采取指数式的方式对模板上的目标区域进行扩增[19]。以上被替换的DNA 链为了防止出现进一步的替换，则会和SSB 进行结合。且因为该种方法所需要的反应环境温度相对较低，仅需保持温度在25～42℃，且反应的速度相对较快(＜1 h)，检测的灵敏度较高，因此可以广泛应用于临床病原微生物核酸的快速检测上。在对探针、RPA 引物进行设计时，只需要一个探针以及一对引物即可帮助荧光检测的反应体系对目标基因进行扩增，还可在整个扩增过程中对扩增进展进行实时的监控[20]。截止目前，普遍认为PCR 核酸检测技术能够被RPA 技术取代，但受技术制约，其仍存在不足，如扩增体系中含有大量蛋白质、PEG 等成分，造成RPA 产物检测困难；没有PCR 的热循环来避免引物之间的结合，故恒定温度下反应难以避免部分非特异性扩增。

3.2.3 NASBA 技术 NASBA 技术是一项在PCR 基础上发展起来的以RNA 为模板的快速等温扩增并能实时监测结果的检测方法，在恒定的温度条件下即可直接扩增单链RNA。该种方法的反应主要是在噬菌体T7RNA 多聚酶、核糖核酸酶H、AMV 逆转录酶以及两种特殊的寡核苷酸引物的帮助下识别其中一个引物（5’端带有T7RNA 聚合酶）的启动子序列，而检测另一引物（5’端拥有和标记电化学）的探针互补序列，借助光电信号辅助，完成流感病毒的RNA 相关定性、定量研究[21]。NASBA 技术属于一种高通量的检测方法，需要反应的条件相对较为温和，且具有全封闭式反应的特点，能有效避免污染物，且在同时筛查多个样本时，具有一定的优势，可通过使用不同荧光基团对分子信标进行标记，同时在同一个反应中进行扩增并对不同的目标RNA 扩增情况进行实时的监测[22]。虽然该种检测方法出现假阴性、假阳性的可能性也不小，但随着便携式NASBA 检测仪的面市，使用该技术更适于现场快速诊断，对于季节性甲、乙型流感病毒快速筛查具有一定的优势。

3.3 液相基因芯片技术

液相基因芯片技术的主要原理依据为流式细胞仪、荧光染料编码的微球。在各个种类的微球上都偶联着具有一定针对性的探针（含有核苷酸片段），且对以上探针以及特异性引物的双重设计可以保证该种方法进行检测的特异性。作为一种相对新型的检测技术，液相基因芯片主要是在多标志物的帮助下对检测通量进行检测[23]。在陈锦龙等[24]的研究中，设计了特异性引物以及探针（甲、乙型流感病毒M 基因的核苷酸序列），且在甲、乙型流感病毒的分型鉴别中，具有相对较高的特异性和重复性。且液相基因芯片主要是通过核酸分子的杂交对流感病毒进行相关分型，并以探针和PCR 产物之间的互补作为进行检测的基础，因此拥有相对较高的检测准确性[25]。近年来，多重荧光RT-PCR 方法被普遍应用于实验室流行病毒分型研究中，且目前多应用于鉴别甲型、乙型流病毒分型。液相基因芯片技术主要通过将两种方法进行结合（多重PCR技术、液相基因芯片技术），可以有效克服设计难度高的多重荧光检测方法的弊端，并可以同时对两种类型的流感病毒的分型进行检测，有利于流感病毒的快速鉴定和诊断。

4 小结与展望

甲、乙型流感是分布于全球的感染性疾病，在历史上已经出现过较多的大流行以及爆发流行，对人类身心健康具有较为直接的危害，也给国家经济发展及社会稳定造成一定威胁，故寻求安全可靠的甲、乙型流感病毒检测方式成为临床研究重点[26]。近年来，临床上对于检测甲、乙型流感病毒的技术随着时间的发展也在不断地进步，且随着多种商品化试剂盒以及新的诊断技术的不断涌现。依据抗原以及核酸进行快速检测的方法由于具有准确而快速的特点，在临床上对于乙型、甲型流感的检测诊断中发挥着举足轻重的作用。然而，对于传统的病毒进行对应分离以及培养是现今临床的研究重点，同时其拥有便宜且容易对新毒株进行检测的优点。而血清学方法检测需要等体内病毒水平蓄积到一定程度才可发现，虽然其检测诊断的速度较慢且无法早期进行诊断，但仍然可以用于甲、乙型流感流行病学的相关调查以及对应的疫苗评估。因此，在甲、乙型流感预防控制的不同环节，可根据诊断技术的各自特点和公共卫生的需要，结合不同地区对流感病毒检测的要求，对检测设备以及方法进行合适的选择，是提高诊断效率的重点。由于临床上流感病毒（甲、乙型）对应药物的耐药性的不断增加，且该类病毒的基因组也在不断变异，因此现今的诊断技术仍需不断的进步，以便于克服将来可能面对的巨大挑战。