补肾益气和血法中药改善体外授精-胚胎移植妊娠结局及其作用机制研究

金志春 郑 洁 夏 敏 刘 杰 孙 虹 雷亚兰 胡兴文 张 纯 吴艳婷 叶朝阳 徐小芳 刘 敏 吴 璇 何 联 姚 娟 张 倩 艾 华

(湖北省妇幼保健院,武汉,430070)

不孕症是一种属于全球范围的特殊生殖健康疾病,据统计,近年来越来越多的家庭受不孕不育问题困扰,不孕症患者已达全球人口的20%,而我国不孕夫妇为7%～15%[1]。目前,辅助生殖技术已经成为治疗不孕症的重要手段,提高辅助生殖妊娠率成为亟待解决的问题。中医药在治疗不孕症方面有一定的优势。研究显示,在体外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization-embryo Transfer,IVF-ET)中使用针药结合可以提高IVF-ET的临床妊娠率[2];中药复方在辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology,ART)治疗过程中,可减少促性腺激素的剂量,降低卵巢过度刺激的发生率,对胚胎形成、植入率、优质胚胎率以及子宫内膜容受性、妊娠率均有显著提高[3]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月至2018年12月在湖北省妇幼保健院生殖中心就诊的171例患者,采用随机数字表法分为观察组(n=85)和对照组(n=86)。观察组年龄最大40岁,年龄最小25岁,平均年龄(29.86±3.11)岁;不孕年限最长为8年,最短为1年,平均不孕年限(2.91±1.71)年;平均体质量指数(Body MassIndex,BMI)(21.44±3.10)kg/m2,平均窦卵泡计数(Antral Follicle Count,AFC)为(13.39±3.92)个。对照组年龄最大39岁,年龄最小25岁,平均年龄(30.20±3.26)岁;不孕年限最长10年,最短1年,平均不孕年限(3.10±2.46)年;平均BMI为(24.49±21.78)kg/m2,AFC为(13.17±4.03)个。2组患者年龄、不孕年限、BMI、AFC比较差异均无统计学意义(均P>0.05),具有可比性。本临床研究经湖北省妇幼保健院伦理委员会批准(伦理审批号:鄂妇幼伦审字第20150017号)。

1.2 诊断标准 女性无避孕,性生活至少12个月未孕者,可诊断为不孕症[4]。

1.3 纳入标准 输卵管因素不孕;女方年龄25～40岁,男方年龄25～45岁;男女双方无全身性疾病影响孕育者;愿意参加研究,并签署知情同意者;男方精液检查指标正常(精液常规检查参照世界卫生组织第五版标准)。

1.4 排除标准 既往有卵巢手术史或盆腔放疗史者;合并子宫内膜异位症、子宫腺肌症和子宫肌瘤者;男女双方一方有较严重的全身性疾病者,如心、肝、肾功能不良、血液疾病、内分泌疾病(如甲状腺、肾上腺功能异常或糖尿病)、全身代谢性疾病、精神疾病、恶性肿瘤、染色体异常。

1.5 脱落与剔除标准 不符合纳入标准者;不按指定要求治疗,或者治疗过程中接受有可能影响有效疗效的治疗者;治疗过程中有比较严重的并发症或者发生其他特殊疾病等不宜继续此治疗者;依从性差,未在规定时间复查或者复诊,资料不全者;自动退出研究者。

1.6 治疗方法

1.6.1 控制性超促排卵、取卵、移植及移植后处理方法 从月经第20天开始肌内注射注射用醋酸曲普瑞林(短效GnRH-a,达菲林,Ipsen Pharma Biotech,法国,批号:u09478)0.1 mg/d,连续14 d后启动促排卵,从启动日开始肌内注射促性腺激素(Gonadotropin,Gn)(重组人促卵泡激素-Gona-F,Recombinant Hunman Follitropin Alfa,商品名为果纳芬,雪兰诺公司,批号:BA072608)150～375 IU/d,直至人绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin,hCG)注射日,在此期间根据卵泡发育情况适当调整剂量。2组均定期检测卵泡,当至少有1个卵泡直径≥17 mm时开始抽血检测黄体生成素(Luteinizing Hormone,LH)、雌激素(Estrogen,E2)和孕激素(Progestogen,P)以确定hCG注射时间。当至少有1个优势卵泡直径≥18 mm时肌内注射hCG(丽珠集团丽珠制药厂,批号:160102)10 000 IU,34～36 h后在超声引导下经阴道常规穿刺取卵,并收集优势卵泡内卵泡液备测。常规方法进行体外受精,有可移植胚胎者取卵日后第3天行胚胎移植。胚胎移植后常规每日肌内注射黄体酮注射液(仙居制药公司,批号:H33020828)60 mg,移植后第14天查血人绒毛膜促性腺激素β亚单位(Human Chorionic Gonadotrophin-β,β-hCG),确定已孕者移植后第28天行阴道超声检查孕囊。

1.6.2 中药治疗方法 取卵日前3个月开始口服补肾益气和血法中药治疗,每日1剂,早晚各1次,连续至移植后3个月。移植前采用补肾益气活血方,用菟丝子15 g、补骨脂10 g、枸杞子15 g、川续断15 g、桑寄生15 g、女贞子15 g、墨旱莲15 g、黄芪15 g、党参15 g、白术10 g、山药15 g、山茱萸10 g、当归10 g、川芎10 g、香附10 g、益母草5 g、白芍10 g、丹参15 g、熟地黄15 g、甘草10 g;临床应用时,应根据症状、体征和舌象,辨证加减;若兼阴虚,潮热盗汗、舌红少苔、脉细数,知母10 g、生地黄15 g、地骨皮15 g;若兼阳虚,怕冷肢寒,可酌加淫羊藿15 g、仙茅10 g、艾叶10 g;若兼脾虚,出现腹泻,口淡无味等,可加砂仁15 g、茯苓10 g。若兼肝郁气滞,出现乳房胀痛,烦躁易怒,加柴胡15 g、香附10 g、郁金15 g;若兼湿热,舌苔黄腻,加黄柏15 g、茵陈30 g、败酱草10 g、薏苡仁20 g;若夜寐不安,心神不宁,加远志15 g、酸枣仁15 g、夜交藤15 g;若瘀结成块,加三棱10 g、莪术10 g、土鳖虫10 g;若合并慢性盆腔炎,小腹腰骶疼痛,加金刚藤30 g、天丁30 g、白花蛇舌草20 g。

月经期方用:当归10 g、川芎10 g、桃仁10 g、红花10 g、三棱10 g、莪术10 g、益母草15 g、川牛膝15 g。

移植后用补肾益气养血方,药用菟丝子15 g、补骨脂10 g、枸杞子15 g、川续断15 g、桑寄生15 g、女贞子15 g、墨旱莲15 g、黄芪15 g、党参15 g、白术10 g、山药15 g、山茱萸10 g、当归10 g、川芎10 g、白芍10 g、熟地黄15 g、甘草10 g。临床应用时,应根据症状、体征和舌象,辨证加减;若肾精亏虚,加女贞子15 g、墨旱莲15 g;若兼阴虚内热,加知母10 g、生地黄15 g、地骨皮15 g;若腰酸较甚,加杜仲15 g;若阴道出血,加杜仲碳15 g、地榆炭15 g、仙鹤草15 g、阿胶15 g;若大便溏薄,加砂仁15 g等。

中药煎服法:先用清水浸泡30 min,以武火煎至汤药沸腾,再改用文火煎30～40 min取汁,共煎煮2次,将汁药混合浓缩200 mL左右,均分成2份,早晚温服(饭前或饭后30 min)。移植前与移植后中药疗程各1～3个月,根据具体症状变化,每1～2周复诊调整用药,中药由湖北省妇幼保健院提供。

1.7 观察指标 临床妊娠相关指标,包括2组受精卵、可移植胚胎、移植胚胎、着床胚胎、临床妊娠等情况。

1.8 疗效判定标准

1.8.1 血清生殖内分泌激素与相关因子 月经周期第3天(降调开始周期)和启动日(降调后开始使用超促排药首日)抽血查内分泌激素促卵泡激素(Follicle-stimulating Hormone,FSH)、LH、E2、P、睾酮(Testosterone,T)、催乳素(Prolactin,PRL)水平,在hCG注射日抽血查LH、E2、P、T水平,采卵日(取卵前)、移植日(移植前)和移植7 d抽血查E2、P、T和胰岛素样生长因子-2(Insulin-like Growth Factor-2,IGF-2)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor,LIF)、转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)水平。抽取静脉血5 mL,离心后取上清液分装,-70 ℃冻存待测。在移植后第14天抽血查β-hCG水平(检测是否受孕)。相关激素检测用电化学发光法,试剂盒由德国罗氏生产,检测方法均按照每种试剂盒提供的说明书操作。相关因子检测试剂盒由武汉云克隆科技股份有限公司及伊莱瑞特生物提供,检测方法均按照每种试剂盒提供的说明书操作。

1.8.2 卵泡液生殖内分泌激素与相关因子在穿刺取卵时先抽取优势卵泡卵泡液(不需要稀释) 检测卵泡液中E2、P、T和IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF、TNF-α水平。入选卵泡标准:卵泡直径大于16 mm,1个卵泡内含有1个卵母细胞,空卵泡除外。在取卵日收取每位研究对象检测侧卵巢卵泡内清亮、无血染的卵泡液,放置于离心器中以3 000 r/min,离心半径13.5 cm,离心10 min,离心后取上清液,分装,-70 ℃冻存待测。激素与因子检测方法相同。

1.8.3 子宫动脉血流阻力情况 在注射hCG日(即卵泡成熟前)和移植日(移植前)超声检查子宫动脉血流阻力。仪器采用深圳S50彩色多普勒超声诊断仪,经阴道检测子宫动脉血流。

1.9 统计学方法 采用IBM SPSS Statistics 19统计软件和PEMS 3.2(Ridit分析用)进行数据分析。2组同期比较,计量资料采用t检验,计数资料采用检验,计数等级资料采用Ridit分析。分析时采用双侧检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者临床妊娠相关指标比较 2组患者均未出现异位妊娠,正常受精数、可移植胚胎数、移植胚胎数,差异均无统计学意义(均P>0.05)。平均着床胚胎数、着床胚胎率、临床妊娠率,观察组高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1～2。

表1 2组患者临床妊娠相关指标个)

表2 2组患者着床胚胎率和临床妊娠率(%)

2.2 2组患者不同时期血清生殖激素比较 在D3及Gn启动日,2组患者血清激素FSH、LH、E2、P、T和PRL水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。hCG注射日,2组患者LH水平比较差异无统计学意义(P>0.05),E2、P、T水平观察组显著低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。取卵日,2组患者T水平比较差异无统计学意义(P>0.05),E2、P 2种激素观察组显著低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。移植日,P、T水平2组比较差异均无统计学意义(均P>0.05),E2水平观察组显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。移植7 d,2组患者E2、T水平差异均无统计学意义(均P>0.05),观察组显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组患者不同时期血清生殖激素比较

2.3 2组患者不同时期卵泡液生殖激素比较 T水平2组患者比较差异无统计学意义(P>0.05);E2水平观察组显著高于对照组,而P水平对照组明显高于观察组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表4。

表4 2组患者卵泡液生殖激素比较

2.4 2组患者不同时期血清IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF及TNF-α水平比较 取卵日及移植日,血清IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF水平观察组均高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);TNF-α水平观察组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。移植7 d,IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、VEGF水平观察组均高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);TNF-α水平观察组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 2组患者血清IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF及TNF-α水平比较

2.5 2组患者卵泡液IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF及TNF-α水平比较 IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF水平观察组均高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);TNF-α水平观察组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 2组患者卵泡液IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF及TNF-α水平比

2.6 2组患者不同时期子宫动脉血流情况比较 hCG注射日,观察组双侧子宫动脉血流搏动指数(Pulse Index,PI)、阻力指数(Resistance Index,RI)均显著低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。移植日,观察组双侧子宫动脉血流PI、RI值均显著低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表7～8。

表7 2组患者hCG日子宫动脉血流情况

表8 2组患者移植日子宫动脉血流情况

3 讨论

目前补肾益气和血法中药改善IVF-ET妊娠结局尚有争议,但有研究提示补肾中药可以改善IVF-ET妊娠结局[5-8],研究结果的不同可能与药物的浓度、剂量、煎药方法以及辨证加减有关。

补肾益气和血中药对IVF-ET妊娠结局的作用机制研究很局限。1)调节神经内分泌功能,补肾中药对女性性腺轴功能具有双相调节作用,能改善女性生殖内分泌激素环境,促使下丘脑-垂体-卵巢轴的调节功能得到改善,提高对促性腺激素的敏感性,改善卵子质量及子宫内膜容受性[9-10],提高IVF-ET的种植率和妊娠率,改善IVF-ET的妊娠结局。2)改善子宫内膜容受性,张琦和张勤华[11]使用温肾活血方治疗反复移植失败患者,发现移植日子宫内膜的腺体弯曲扩张,分泌活跃,间质疏松,与腺体发育同步,可见整齐的核下空泡,并能明显增加增殖期内膜的厚度,在其向分泌期转化过程中还能维持内膜厚度,监测血流显示在内膜及内膜下均能见到丰富血流,且螺旋动脉PI、RI均较低,提示温肾活血方能改善患者“种植窗”期子宫内膜形态,增加内膜血液循环,增加子宫内膜容受性,为胚胎着床创造有利条件。许娟等[12]研究发现,温经祛瘀中药可提高胞饮突的表达,使子宫内膜腺体弯曲,腺上皮柱状、假复层、腺腔面上皮表面出现较多微绒毛样突起,腺体间质组织疏松,间质内小血管增生,胚胎着床率更高。3)防治卵巢过度刺激,陈小燕等[13]采用益气血补肝肾中药干预IVF-ET过程,观察发现服中药患者中重度卵巢过度刺激综合征发生率不高,具有较高优质胚胎率,移植日VEGF表达较低,表明中药可能通过降低患者移植日后的血清VEGF来降低中重度卵巢过度刺激综合征的发生。

女性生殖内分泌激素是生殖功能的基础,其主要生理功能是控制性发育、正常月经及性功能。参与生殖的性激素主要有FSH、LH、E2、PRL、P、T和hCG。本研究中,2组病例基础状态的各项内分泌平均值与正常妇女类似,且2组间差异无统计学意义,经过垂体降调节后,启动日2组血清生殖内分泌激素比较差异均无统计学意义,且均达到了垂体抑制状态。基础状态和启动日生殖内分泌激素状态,提示2组患者在补肾益气和血法中药治疗前相似,具有可比性。

本研究中,hCG注射日,E2、P、T 3种激素2组比较均有显著性差异,观察组3种激素均显著低于对照组。在IVF-ET时,hCG注射日血清E2、P、T水平均明显高于正常妇女同期水平,LH水平2组比较差异无统计学意义,提示补肾益气和血法中药有一定的降调E2、P和T水平的作用,但对LH水平2组未产生显著性差异。取卵日,E2和P 2种激素观察组均显著低于对照组,T水平2组比较差异无统计学意义,提示中药有一定的降调E2、P水平的作用,但对T水平2组差异无统计学意义。移植日,E2在观察组显著低于对照组,2组比较差异有显著性,P、T 2种激素2组比较差异均无统计学意义,提示中药对移植日过高的血清E2有一定的降低作用,但对移植日P和T无明显影响。移植7 d,E2在观察组显著高于对照组,P、T水平2组比较差异无统计学意义。提示中药对移植7 d血清E2有一定的升调作用,但对移植日P和T无明显影响。卵泡液中,E2在观察组明显高于对照组,而P则相反,在对照组显著高于观察组,T水平2组比较差异无统计学意义,提示补肾益气和血法中药对卵泡液中E2水平有一定的升调作用,对卵泡液中的P水平有一定的降调作用,但对卵泡液中的T水平影响不明显。

人类生殖功能的调节受多种因素的影响,目前所了解的具有一定的局限性,IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1、VEGF、TNF-α与生殖密切相关。IL-1β是IL-1其中的一种,对女性生殖的调节是多途径的,一是通过血液循环直接作用于生殖中枢,二是在卵巢、子宫及卵泡液中局部表达,通过对黄体细胞孕酮分泌及对Na+-K+-ATP酶活性的影响,参与生殖调节[14]。IL-6则参与妊娠和女性生殖内分泌的建立、胚泡着床及其胚胎生长发育等生理活动[15]。研究发现,LIF参与生殖的各个环节,其具有抑制多向生长潜能的胚胎干细胞分化并保持其增殖的作用,可以促进卵泡发育成熟、诱发排卵,促进胚胎发育和着床,影响妊娠率。IGF-2可影响卵泡发育、优势卵泡的选择、卵母细胞成熟、胚胎早期发育、内膜分化、胚胎着床及甾体激素合成等[16-18]。TGF-β1主要在初级卵泡的卵母细胞、窦卵泡的膜细胞和颗粒细胞中表达,对于卵泡发育及妊娠过程起着重要作用[19]。在卵泡生长发育过程中,VEGF诱导的血管化在优势卵泡的确定和促性腺激素的传递中起重要作用[20]。MORIZANE等[21]研究发现TNF-α通过诱导卵细胞、间质细胞及颗粒细胞凋亡,参与卵泡的闭锁过程,因而,卵泡液中TNF-α水平升高(如子宫内膜异位症患者)可致不孕高发。本研究显示,补肾益气和血法中药对取卵日和移植日血清IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1和VEGF 6种相关因子可能有一定的升调作用,对TNF-α有一定的降调作用,对移植7 d血清IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF和VEGF 6种相关因子可能有一定的升调作用,对TNF-α有一定的降调作用,但对TGF-β1无明显影响。对卵泡液中IGF-2、IL-1β、IL-6、LIF、TGF-β1和VEGF 6种相关因子可能有一定的升调作用,对TNF-α有一定的降调作用。

子宫动脉(Uterine Artery,UtA)是胚胎着床及其生长发育所需的母体血供来源,子宫内膜和内膜下血流则直接反映了胚胎着床部位微环境的血流灌注情况,内膜和内膜下血流增多有利于胚胎着床和妊娠,而内膜和内膜下无血流或血流缺乏往往代表一个较差的子宫环境,常伴有高龄、内膜薄、子宫动脉阻力指数高[22]。本研究结果发现,观察组双侧子宫动脉血流PI、RI均显著低于对照组,提示补肾益气和血法中药可能降低子宫动脉血流指数,改善子宫供血,有利于卵泡发育、胚胎着床和胚胎发育。

综上所述,本研究结果显示,补肾益气和血法观察组胚胎着床率、临床妊娠率均显著高于对照组,提示补肾益气和血法中药介入IVF-ET可能提高着床率,改善妊娠结局。

利益冲突声明:无。