疏肝平喘方通过转化生长因子-β1/Smad信号通路对哮喘小鼠免疫平衡的影响

顾静雯 朴 香 傅 伟 程克文 董晨洁 沈毅韵

(1 上海市宝山区仁和医院,上海,200431; 2 上海中医药大学,上海,201203; 3 上海中医药大学附属宝山医院,上海,201999)

儿童时期最常见的慢性气道疾病是支气管哮喘,它是以慢性炎症、气道高反应为特征的异质性疾病,主要表现为反复的咳嗽、喘息、胸闷、气急[1]。流行病学调查显示,儿童哮喘的发病率约为1%～4%,我国每10年即增加50%以上的儿童哮喘患者,因此,最有效的控制儿童哮喘的方式就是及时诊断并接受规范化的治疗[2-3]。目前主要的研究认为,Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡导致疾病的发生。在前期的研究中,我们发现,疏肝平喘方对哮喘患儿具有一定的疗效,表现在能够减轻咳嗽症状,改善中医证候,抑制气道炎症,现进一步研究其作用机制,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 40只清洁级雄性BALB/c小鼠(体质量18～22 g),4～6周龄,于上海斯莱克实验动物有限公司采购,公司许可证号:SYXK(沪)2017-0008。动物伦理审批号:PZSHUTCM210919010。饲养于上海中医药大学动物房。环境室温25 ℃、湿度60%～70%,IVC-Ⅱ型独立送风笼中适应性饲养1周。

1.1.2 药物 疏肝平喘方由炙麻黄6 g(批号:200401)、苦杏仁9 g(批号:200301)、生石膏15 g(批号:200201)、生甘草6 g(批号:200302)、紫苏子9 g(批号:200402)、莱菔子9 g(批号:200501)、地龙干9 g(批号:200102)、桃仁9 g(批号:200202)、椒目6 g(批号:200101)、黄芩9 g(批号:200502)、柴胡6 g(批号:200403)、白芍9 g(批号:200203)、丹参9 g(批号:200403)组成,由上海虹桥中药饮片有限公司提供。以上药材煎煮提取方法参照《中药药理实验方法学》(上海科学技术出版社,2006年)以及临床实际应用的煎煮方法。地塞米松购自辰欣药业股份有限公司(批号:2003012211)。

1.1.3 试剂与仪器 卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA,美国Sigma公司,货号:A5253)、氢氧化铝(AlOH3,国药集团化学试剂有限公司,批号:20171150)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、IL-10、IL-17A、转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)酶联免疫吸附试验试剂盒购于上海酶研生物科技有限公司(货号:EK-R36902、EK-R36864、EK-R38788、EK-R38727)。核孤儿受体(Retinoid-related Orphan Nuclear Receptor,ROR)γt抗体、叉头框蛋白(Forkhead Box ProteinFox)p3抗体(上海雅吉生物科技有限公司,货号:IHC0113587,IH-0269R)。反转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction,RT-PCR)RT-PCR试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,货号:mIE6067)。超声雾化器(江苏鱼跃,型号:503AI型),全自动酶标仪(BioTek公司,美国,型号:ELX808),流式细胞仪(BD公司,美国,型号:FACSCalibur),石蜡切片机(Leica,德国,型号:RM2235),PCR分析仪(罗氏公司,瑞士,型号:LightCycler.480Ⅱ),电泳槽、转印槽、成像分析系统(Bio-Rad公司,美国,型号:Fluorchem FC3)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 40只小鼠按随机数字表法分为4组,每组10只:空白对照组、哮喘模型组、地塞米松组、疏肝平喘方组。按照以往支气管哮喘成熟的造模条件,建立哮喘模型。除空白对照组外,在第1天和第14天,每只实验小鼠给予10%OVA混合液注射致敏;第23天到第29天,将实验小鼠放置于5升的密闭容器中,用5%OVA+生理盐水超声雾化,每日1次,每次40 min,诱发哮喘。空白对照组实验小鼠给予等量生理盐水注射并超声雾化。

1.2.2 给药方法 各个实验组均在致敏后2周开始灌胃,1次/d,灌胃1周。根据《实验动物方法学》(人民卫生出版社,2001年)中公式dB=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3,计算实验剂量。疏肝平喘方组用0.1 mL/(g·d)剂量的药液灌胃(原生药浓度为5.33 g/mL);地塞米松组用0.1 mL/(g·d)剂量的药液灌胃(地塞米松浓度为0.075 mg/mL);空白对照组、模型组用0.1 mL/(g·d)的生理盐水灌胃。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 肺组织病理 小鼠处死后开胸取部分右侧肺组织,将其用甲醛固定48 h,再用乙醇脱水、二甲苯透明,最后浸蜡包埋,运用苏木精(Haematoxylin)、伊红(Ehong)进行HE染色并封片。

1.2.3.2 ELISA检测肺组织IL-6、IL-10、IL-17A和TGF-β1水平 取小块肺组织加入裂解液进行裂解,按ELISA试剂盒说明书进行操作,在450 nm波长依次测定各孔的吸光度值,计算后得出各实验小鼠肺组织中IL-6、IL-10、IL-17A和TGF-β1的实际浓度。

1.2.3.3 蛋白质免疫印迹法检测肺组织中RORγt、Foxp3的蛋白表达 取小鼠少量右侧肺组织,分解成碎片,加入裂解液匀浆,按12 000 r/min,离心半径5 cm,离心10 min取上清,进行蛋白质免疫印迹法检测肺组织中RORγt、Foxp3的蛋白表达。

1.2.3.4 RT-PCR 检测肺组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表达水平:取小块右侧肺组织进行裂解,参照Trizol方法测定肺组织中的mRNA表达水平。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况比较 空白对照组实验小鼠呼吸平稳,毛发有光泽,进食饮水、排便情况等均正常。哮喘模型组小鼠经雾化激发后,出现呼吸急促,蜷缩,易激惹、肌肉颤动、毛发竖立,进食进水少,大便失禁等表现。疏肝平喘组和地塞米松组小鼠用药后呼吸急促缓解,活动度较前改善,其他一般情况良好。

2.2 电镜下各组小鼠肺组织病理学改变 空白对照组肺组织完整,肺泡内未见炎症细胞渗出,支气管壁结构完整光滑,管腔内径正常,无炎性渗出,肺间质无水肿。哮喘模型组肺组织中肺泡有渗出,支气管变形,管径变窄,管腔内有大量的炎性渗出物,肺间质有水肿,有炎症细胞浸润及积聚。疏肝平喘方组肺组织间少许破坏,支气管管径稍窄,管内有少许炎症细胞浸润,肺间质无水肿,地塞米松组支气管壁结构完整,管周有少许的炎症细胞浸润,肺间质无水肿。见图1。

图1 电镜下各组小鼠肺组织病理学改变(HE染色,×100)注：A.空白对照组,B.哮喘模型组,C.疏肝平喘方组,D.地塞米松组

2.3 肺组织中IL-6、IL-10、IL-17A和TGF-β1水平比较 与空白对照组比较,哮喘模型组IL-6、IL-17A和TGF-β1水平均升高,IL-10水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。同哮喘模型组比较,疏肝平喘方组和地塞米松组的的IL-6、IL-17A、TGF-β1水平均降低,IL-10水平增高(均P<0.05)。与地塞米松组比较,疏肝平喘方组IL-6、TGF-β1水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05),IL-10、IL-17A差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 各组肺组织中IL-6、IL-10、IL-17A和TGF-β1水平比较

2.4 流式细胞仪检测肺组织中Treg和Th17细胞量 与空白对照组比较,哮喘模型组CD4+IL-17A+/CD4+、CD4+Foxp3+/CD4+、Th17/Treg的比值均增高,差异有统计学意义(P<0.05)。同哮喘模型组比较,地塞米松组、疏肝平喘方组的CD4+IL-17A+/CD4+、CD4+Foxp3+/CD4+、Th17/Treg的比值均降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。疏肝平喘方组与地塞米松组相比,以上三项数值差异没有统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组肺组织中Th17和Treg细胞量比较

2.5 肺组织中RORγt、Foxp3的蛋白表达 与空白对照组比较,模型组中RORγt蛋白升高,Foxp3蛋白下降,差异有统计学意义(P<0.05)。同哮喘模型组相比,地塞米松组、疏肝平喘方组中RORγt蛋白下降,Foxp3蛋白增高,差异有统计学意义(P<0.05)。疏肝平喘方组同地塞米松组相比,RORγt/Foxp3表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组肺组织中RORγt、Foxp3的蛋白表达

2.6 肺组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表达 与空白对照组比较,哮喘模型组的TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05),而Smad7的表达水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。同哮喘模型组相比,疏肝平喘方组、地塞米松组的TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表达水平降低,而Smad7的mRNA水平增高,差异有统计学意义(P<0.05)。同地塞米松组相比,疏肝平喘方组的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA水平差异没有统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表达水平

3 讨论

现代研究表明,气道炎症是哮喘急性发作期的重要机制,近年来研究发现Th17/Treg免疫平衡的打破所导致的炎症反应在支气管哮喘的发生、发展过程中起着重要的作用[4]。过去的二十多年,关于哮喘的发病机制,研究的重点一直集中在Th1/Th2细胞因子的平衡,但是近年来,随着新的效应性CD4+T细胞亚群Th17的发现,其已成为新的研究热点。Th17细胞作为促炎细胞,即可增强机体防御能力,又能加强炎症反应,诱导自身免疫性疾病的发生[5]。研究发现,哮喘患儿在急性期其外周血中Th17细胞明显高于缓解期患儿和健康儿童,同时增高程度和哮喘儿童的病情呈正相关[6]。Th17特异性地产生IL-17效应因子,IL-17A的高表达和哮喘相关。Treg细胞通过抑制效应T淋巴细胞活化、增殖及杀伤毒性作用来抑制机体免疫反应,Treg细胞数量、功能的失调会导致自身免疫反应和多种严重的超敏反应。Treg细胞分泌lL-4、lL-10和TGF-β1,其介导的免疫耐受在哮喘的发生发展中起重要调节作用,与呼吸道炎症密切相关[7]。

综上所述,哮喘发病中的一个重要因素即促炎Th17细胞和抑制性Treg细胞间平衡的失调。Treg与Th17之间在功能和分化上互相遏制,但具体的机制有待进一步研究。研究表明,CD4+Foxp3+的T细胞是小鼠体内Th17和Treg的共同前体细胞,加入TGF-β1时,前体细胞转化为Treg细胞,加人TGF-β1和IL-6时,前体细胞转化为Th17细胞。其中IL-6作为关键因子决定前体细胞转化为Treg细胞或者Th17细胞,并且这两种转化作用是互相排斥的[8]。本研究发现,与哮喘模型组比较,地塞米松组、疏肝平喘方组肺组织中的IL-6、IL-17A、TGF-β1水平均降低,IL-10水平增高。检测肺组织Treg和Th17细胞量,与哮喘模型组比较,地塞米松组、疏肝平喘方组的CD4+IL-17A+/CD4+、CD4+Foxp3+/CD4+、Th17/Treg的比值均降低。说明疏肝平喘方能够调节哮喘小鼠炎症介质水平,从而减轻哮喘小鼠气道炎症。

RORγt是Th17细胞的系别决定性转录因子,驱动NaiveT细胞向Th17细胞分化[9]。RORγt在T细胞的分化调控中发挥重要作用,它能够调控T细胞和免疫器官的发育和成熟,以及细胞因子的产生,是诱导Th17分泌IL-17的关键转录因子[10]。Foxp3可通过外显子2编码序列与RORγt结合,减少RORγt对IL-17表达的抑制作用,而且抑制Foxp3与DNA的结合能力可以减少对IL-17表达的抑制[11],提示RORγt/Foxp3的表达与Th17/Treg细胞平衡密切相关。初始T细胞被抗原刺激后朝Th17还是Treg方向转化是由细胞因子调节的RORγt/Foxp3平衡决定的[12]。此次研究发现,同哮喘模型组相比,地塞米松组、疏肝平喘方组肺组织中RORγt蛋白表达下降,Foxp3蛋白表达上升,与地塞米松组相比,疏肝平喘方组RORγt/Foxp3表达差异没有统计学意义。提示疏肝平喘方使RORγt/Foxp3蛋白的表达降低,使Th17/Treg免疫失衡向调节性T细胞倾斜。

TGF-β1是一种重要的炎性介质及致纤维化生长因子,促进气道炎症的发生发展,上调炎症细胞及多种细胞因子的表达,参与气道重塑[13-14]。气道重塑是哮喘治疗的难点之一,也成为过去几年研究的热点。其中TGF-β1/Smad信号通路是气道重塑中的重要因子而受到关注。Smad是目前已知的唯一TGF-β1受体的胞内激酶底物,其参与TGF-β1在细胞内的信号转导功能。TGF-β1在气道重塑中的生物活性通过Smad蛋白信号传导途径实现,同时,TGF-β1通过调节信号蛋白的活性进一步促进细胞外基质的合成,此过程在气道重塑纤维化形成过程中有重要作用[15]。Smad蛋白参与调控细胞的增殖、分化、合成、分泌和凋亡过程,直接介导TGF-β1在胞内信号转导过程[16]。由于蛋白结构和功能的不同,Smad蛋白家族信号转导的作用也是不同的。家族9种蛋白中Smad2、Smad3为受体调节型蛋白,Smad4为通用调节型蛋白,Smad6、Smad7为抑制型蛋白,以上蛋白都参与TGF-β1的信号转导[17]。

近来研究发现,TGF-β1/Smad信号通路在机体Treg/Th17分化平衡中起重要的调控作用。机体处于炎症状态时,TGF-β1/Smad信号通路被激活,通过活化Smad2/3、抑制Smad7,从而可能启动RORγt介导的Th17细胞的分化,导致Th17/Treg细胞免疫平衡的破坏。本研究中发现,哮喘模型组的Smad2、Smad3的mRNA表达水平增高,但是Smad7的表达水平明显下降,与哮喘模型组比较,疏肝平喘方组、地塞米松组的Smad2、Smad3的mRNA表达水平降低,但是Smad7的表达水平增高。提示该方通过调节TGF-β1/Smad信号通路改善气道炎症。

平喘方是继承海派徐氏儿科的经验方,临床应用20余年,对于哮喘、咳嗽变异性哮喘等疾病,辨证使用,具有良好的疗效。该方立法宣肺平喘、化痰祛瘀[18]。近年来,因患儿情志起病病因增多,故而在其基础上增加上了柴胡、白芍加强疏肝理气作用,增加了丹参加强活血作用,宣肺平喘、疏肝理气,活血祛瘀。是从“肺”与“肝”两脏入手,调畅肺气,并且理气,并使“痰瘀”祛除。

前期对疏肝平喘方的研究发现,其对咳嗽变异性哮喘患儿良好的临床疗效[19]。该方对哮喘小鼠升高的IL-13水平及mRNA均有降低作用,对其降低的IL-18水平及mRNA均有升高作用,对IL-13/IL-18比值的调节同地塞米松的作用相似,表明疏肝平喘方对哮喘小鼠Th1/Th2免疫失衡的调节有较为确切的干预作用[20]。

本研究验证了疏肝平喘方能够改善哮喘小鼠的气道炎症,调节Th17/Treg免疫失衡,TGF-β1/Smad信号通路是该方调节Th17/Treg免疫平衡上游通路,对于细胞炎症介质有调节作用,从而进一步改善肺组织炎症,改善气道狭窄。该实验作为有益的探索,将为新药研发与推广提供实验依据。

利益冲突声明:无。