贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1 的抗菌特性及应用

■ 尤 巧 李焱辉 王 彤 赵陆宇 彭文婷 王欣雨 林 凌 黄炜乾，2*

（1.安徽师范大学生命科学学院，安徽芜湖 241000；2.清远一生自然生物研究院有限公司，广东清远 511500）

自从20 世纪40 年代青霉素被应用于医疗以来，各种抗生素被发现且广泛使用[1]，其负面影响日渐突出；同时长期使用抗生素会造成畜禽机体的免疫力下降，引起畜禽肠道菌群失衡，在畜产品和环境中造成残留等多种不良影响[2]，也导致细菌抗药性越来越普遍和严重。为了应对上述问题，农业农村部发布了饲料“禁抗”令（第194号公告），明确了严禁使用11种含促生类药物饲料添加剂（土霉素钙预混剂、杆菌肽锌预混剂、阿维拉霉素预混剂、恩拉霉素预混剂、喹烯酮预混剂、黄霉素预混剂、维吉尼亚霉素预混剂、那西肽预混剂、吉他霉素预混剂、金霉素预混剂、亚甲基水杨酸杆菌肽预混剂）。我国自2020 年7 月1 日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料，并实施“全面禁止在饲料中添加促生长类抗生素”的法规[3-4]，采取了对饲料进行“减抗/替抗”的措施[5]。抗生素替代品是应形势而生的绿色、无污染、无耐药性的生物活性物质，能够在促进动物生长的同时维护动物健康[6]。近年来，抗生素替代品的开发与应用成为了畜牧业研究与生产的热点问题[7]，也是促进对养殖业健康发展的有力措施[8-10]。

益生菌（probiotic）是指由许多有益微生物及其代谢产物构成的可以直接饲喂动物的活菌制剂[11-12]。益生菌对病原体的作用可能是通过竞争肠黏膜上的受体、竞争营养、产生抗菌物质和刺激免疫来介导的[13-14]。与使用传统抗生素相比，补充益生菌不仅能提高动物生长性能，还能维持肠道微生物的平衡，预防病原性疫病的发生，提高牲畜的生产效益。因此，益生菌作为一种新型的微生物饲料添加剂，是非致病性微生物，是潜在的重要的非抗生素替代品[15]。

芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌广泛分布在不同的自然环境（如空气、水、人类和动物肠道、蔬菜等）中[16]，被广泛应用于生产酶、抗生素、杀虫剂、表面活性剂和精细生化制品，包括增味剂和食品添加剂等行业[17]。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）是芽孢杆菌属的一个新种[18]，在生长繁殖过程中能产生芽孢，为需氧或兼性厌氧革兰氏阳性菌[19]。贝莱斯芽孢杆菌适应能力强，分布广泛，对于外界不良因素抵抗力强，生长快速且稳定，不会对人体和环境造成危害。研究发现，贝莱斯芽孢杆菌可以产生多种抗菌物质（包括脂肽类、肽类等），对常见病原菌具有良好的抑制作用[20]，是重要的动植物病害生防微生物。对贝莱斯芽孢杆菌的深入研究，有助于未来解决抗生素滥用以及耐药菌严重威胁人类健康安全等问题[21]。此外，该菌在生物防治、研发药物和食品发酵等方面也有着重要应用[22]。

近些年来，随着对贝莱斯芽孢杆菌研究的不断深入，人们开始探索其背后尚未人知的作用机制及其在生产领域中的运用。贝莱斯芽孢杆菌可作为生防菌得益于其所能产生的抗菌物质，对抗菌物质的相关研究在生物防治中有着重要的意义。试验通过分离鉴定获得具有抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌，并通过对其相关抗菌特性的研究，探索其抗菌物质的特性和抑制机制，以及在畜禽生产过程中的应用和推广潜力。

1 材料与方法

1.1 试验动物、菌株及日粮

试验动物为商品罗曼灰蛋鸡。

试验所使用的贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1 为分离所得，指示菌大肠杆菌MG1655和大肠杆菌DH5-GFP为本实验室保存；酵母粉、蛋白胨购自OXOID 公司，所用化学纯试剂均购自国药集团。

基础饲粮组成：玉米62.5%，豆粕（46%）12%，膨化大豆11%，棉粕（46%）3%，碳酸钙9.5%，磷酸氢钙1%，食盐0.25%，蛋氨酸0.15%。微量元素维生素预混料（预混料向每千克日粮提供：植酸酶50 mg，Fe 50 mg，Cu 5.5 mg，Zn 65 mg，Mn 55 mg，I 1.5 mg，Se 0.3 mg，Co 0.2 mg；VA 9 800 IU，VD33 500 IU，VE 25 IU，VK32.2 mg，VB11.7 mg，VB25.5 mg，VB63.3 mg，VB1222 μg，泛酸6.8 mg，烟酸28 mg，生物素60 μg，叶酸0.6 mg）0.5%，氯化胆碱0.1%。

1.2 试验试剂

LB 液体培养基(1 L)：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，pH调节至7.4。

LB 固体培养基(1 L)：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂粉15 g，pH调节至7.4。

检测固体平板：将1 mL 1 OD600值为1（×108CFU/mL）的大肠杆菌MG1655菌液加入100 mL LB 固体培养基中，混匀后制备检测平板。

检测液体培养基：将1 mL OD600值为1（×108CFU/mL）的大肠杆菌MG1655菌液加入100 mL LB 液体培养基中，混匀后得到检测液体培养基。

发酵培养基：葡萄糖5%、豆粕粉10%、硫酸铵1.0%、维生素B10.005%，pH调节至6.5。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的分离与鉴定

取海洋底泥样品混匀在无菌水中，稀释涂布于LB固体培养基平板上，于28 ℃恒温培养，至长出单菌落。挑取单菌落分别点样于检测平板上，28 ℃恒温培养1～3 d，选择有抑菌圈的菌种进行后续研究参考文献方法[23]。

以提取的菌株基因组为模板，分别用细菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR 扩增。产物由通用生物(滁州)有限公司进行DNA 序列测定，将测得的序列使用 NCBI 的BLAST 分析比较[24-25]。根据菌种比对结果，选择亲缘关系近的不同菌种序列，使用MEGA软件制作进化树。

1.3.2 抗菌代谢物制备

将贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1 单菌落接种于含有3 mL LB 液体培养基的西林瓶中，37 ℃，180 r/min，培养16 h。按1%(V/V)将菌液接种到200 mL LB培养基，37 ℃、180 r/min 培养20 h。培养液于9 000 r/min，4 ℃，15 min 离心后，上清液经0.22 μm 微孔滤膜过滤，50 ℃真空干燥后得抗菌代谢物。

1.3.3 抗菌代谢物抑菌特性测定

1.3.3.1 抗菌代谢物的最低抑菌浓度

在西林瓶中分别加入0～90 mL 10%的抗菌代谢物和检测液体培养基（总体积3 mL），以无菌水为阴性对照。37 ℃、180 r/min 培养8 h，测定培养基中的菌体吸光度值OD600计算抑菌率。

1.3.3.2 抗菌代谢物的抑菌时间

取80 mL 10%的抗菌代谢物与检测液体培养基混合于西林瓶中，设无菌水为空白对照。37 ℃，180 r/min，振荡培养8 h，每隔1 h取样稀释涂布LB固体平板上，37 ℃恒温培养12 h，观察记录平板的菌落数。

1.3.3.3 温度对抗菌代谢物抗菌活性的影响

配制10%的抗菌代谢物溶液，分别置于50～100 ℃中水浴24 h，每隔2 h 取样加入检测液体培养基，37 ℃、180 r/min 恒温摇床培养8 h 后，计算不同温度处理后的抗菌代谢物的抑菌率。

1.3.3.4 pH对抗菌代谢物抗菌活性的影响

参考《分子克隆实验指南》[26]分别配制pH 2～11缓冲液（磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH 2～8 和碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液pH 9～11），将抗菌代谢物放入不同pH 缓冲液中静置3 h 后，取80 mL 溶液进行抗菌检测，计算不同pH缓冲液处理后抗菌代谢物的抑菌率。

1.3.4 抗菌代谢物的抑菌机制

取80 mL 10%的抗菌代谢物与检测液体培养基混合于西林瓶中，总体系的量为3 mL。置于37 ℃、180 r/min 恒温摇床中培养，每隔2 h 取样。样品经品红染色、制片干燥后，将载玻片置于相差显微镜下进行观察拍照，通过细胞形态变化进一步分析抑菌机制。

取80 mL 10%的抗菌代谢物与检测液体培养基混合于西林瓶中，总体系的量为3 mL。置于37 ℃、180 r/min 恒温摇床中培养，每隔2 h 取样。取样后显微观察，样品经制片干燥后置于荧光显微镜下进行观察拍照，通过细胞在荧光下数量以及形态的变化进一步来分析抑菌机制。

1.3.5 抗菌代谢物的生产应用

将贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1 接种于LB 固体培养基，于37 ℃培养48 h进行菌株活化；将活化的单菌落接种于含有200 mL LB 液体培养基的三角瓶中，37 ℃、180 r/min 培养20 h 得到种子液；将种子液接种到发酵培养基中，37 ℃、500 r/min 培养48 h，于培养过程中持续通入无菌空气，制得发酵液；发酵液经离心后，加入碳酸钙5.0%和脱脂米糠5%，然后直接进行喷雾干燥，制备得贝莱斯芽孢杆菌代谢物制剂。

选择体重1.3 kg 左右的罗曼灰产蛋鸡8 000 只，按饲养试验要求随机分成对照组（5 个对照组，每组800只）和试验组（5个试验组，每组800只），分别饲喂添加抗菌代谢物为0、200 mg/kg 的日粮。试验鸡采用群饲，自由采食，自由饮水。试验期30 d，试验期间每日记录耗料量，饲养试验结果时统计母鸡的产蛋性能，计算试验鸡的产蛋率、烂蛋率、畸形蛋率和死亡率。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与鉴定

将海洋底泥中分离出来的菌株进行平板划线培养，获得长势良好的单菌落见图1。菌落表面湿润，为不透明的乳白色凸丘，且菌落边缘不规则，呈现出典型的细菌形态特征。

图1 目标贝莱斯芽孢杆菌菌落

取液体培养获得抗菌代谢物溶液进行牛津杯抑菌检测，37 ℃恒温培养12 h，测量平板上的抑菌圈大小，结果见图2。抗菌代谢物在检测平板上形成了明显的抑菌圈，具有明显的抑菌效果，选取该菌种进行后续研究。

图2 抗菌代谢物的平板抑菌试验

提取菌株的基因组DNA，扩增 16S rDNA 序列测序，使用NCBI 的BLAST 及MEGA 软件建立进化树确定菌株的分类地位，分析比较其与近源种属的进化关系(图3)。结果显示，目标菌株的16S rDNA 基因序列与B.velezensisWh-1 的16S rDNA 序列位于系统发育树同一分支，亲缘关系最近，且它们都并归于芽孢杆菌属（Bacillus）中。基于以上分子生物学鉴定结果，结合形态学和生理生化特性，鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌Bacilus velezensis，命名为BzAH-1。

图3 贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1核糖体基因的系统进化分析

2.2 贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1的抗菌代谢物特性

2.2.1 抗菌代谢物的最低抑菌浓度

取不同浓度抗菌代谢物进行抑菌试验，结果见表1。随着抗菌代谢物含量的不断增加，菌液的吸光度值呈现下降趋势，抑菌率增加。当加入抗菌代谢物80 mL 时，菌液OD600与初始值一致，抑菌率为98.1%，几乎完全抑制指示菌的生长。后续均采用80 mL 的抗菌代谢物进行抑菌试验。

表1 不同浓度抗菌代谢物的抑菌效果

2.2.2 抗菌代谢物的抑菌时间

取不同培养时间的抑菌反应液稀涂布于LB 平板，37 ℃培养12 h 后观察指示菌的生长状况。结果见图4。在培养的0～5 h 内，平板上几乎无指示菌的生长即抗菌代谢物持续发挥其抗菌作用；而在培养6 h后，平板上开出现菌落，表明抑菌效果开始减弱。因此，抗菌代谢物的有效抑菌时间约为6 h。

图4 不同处理时间对指示菌生长的抑制作用

2.2.3 温度对抗菌代谢物抗菌活性的影响

在不同温度下处理抗菌代谢物溶液，获得温度对其活性的影响，结果见图5。50～70 ℃处理24 h 的抗菌代谢物的抑菌活性无明显变化；处理温度达到80 ℃时，抗菌代谢物稳定性开始下降；100 ℃处理4 h后抗菌代谢物将失活。

图5 温度对抗菌代谢物抗菌活性的影响

2.2.4 pH对抗菌代谢物抗菌活性的影响

如图6、图7 所示，抗菌代谢物在pH 2～11 的缓冲液中处理3 h 后，抑菌活性没有明显变化。该结果表明抗菌代谢物结构性质非常稳定，可以耐受环境酸碱度对其活性和稳定性的影响。

图6 抗菌代谢物对不同pH环境的耐受性

图7 不同pH对代谢物抗菌活性的影响

2.3 抗菌代谢物的抑菌机制

将抗菌代谢物处理2、4、6、8 h 的菌液样品染色、干燥制片后，于相差显微镜下进行观察，结果见图8。空白对照样品随着培养时间的增加，指示菌的数量和大小也不断的增多和增大；而加入抗菌代谢物的样品中，指示菌的形态较小且杂乱，推测抗菌代谢物可使细菌的细胞膜破裂从而发挥抑菌作用。随着培养时间的增加，抗菌代谢物抑菌效果下降后，剩余指示菌则又开始恢复生长。

图8 相差显微分析指示菌形态变化

将处理2、4、6、8 h获取的样品制作载玻片于荧光显微镜下进行观察。结果见图9。空白对照中的指示菌的数量和大小都随着培养时间增加而不断的增多和增大；而试验组指示菌的细胞数量随着培养时间增加而不断的减少，指示菌的大小也随着培养时间增加而不断的减小。因此，抗菌代谢物可能通过作用于细菌的细胞膜结构引起细胞破裂从而发挥其抑菌作用。

图9 荧光显微分析指示菌形态变化

2.4 贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1抗菌代谢物的应用

选择产蛋母鸡8 000只随机分配为对照组和试验组，对照组喂食正常日粮，试验组在正常日粮中添加200 mg/kg 的代谢物制剂，试验期30 d，自由采食和饮水，结果见表2。代谢物制剂的添加明显提高了蛋鸡的生产性能，不仅将产蛋率提高了4.63%，同时死亡率降低28.5%，烂蛋和畸形蛋分别降低22.3% 和37.5%。

表2 贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1抗菌代谢物对蛋鸡产蛋性能的影响（%）

3 讨论

近年来，人们对食品安全越来越关注，减少化学农药的使用已成为当务之急。随着绿色健康发展的深入推进，我国越来越重视化学农药和抗生素的使用，努力缓解其对环境的重大负面影响。因此，作为饲料添加剂的益生菌及抗菌代谢物的研发，有助于提高畜禽产品质量、促进绿色畜牧业的发展，显示出广阔的应用前景[27]。本试验结果显示，贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1 作为一种革兰氏阳性好氧细菌，在抑制病原菌和生物防治方面具有显著的优点。其发酵代谢产物中富含的抗菌物质对大肠杆菌的生长和繁殖具有很强的抑制和杀灭作用。该抗菌代谢物质可以耐受24 h 70 ℃的高温而不丧失活性，其耐酸性可以耐受蛋鸡酸性胃液的腐蚀，从而维持制剂的生物活性，使其进入蛋鸡肠道发挥抗菌、保健的作用。此前，多数学者报道芽孢杆菌具有较好的杀灭病原微生物的作用，在日粮中添加抗菌物质能促进肠道健康，能保证鸡健康生长[28]，同时改善蛋鸡的产蛋性能[29]。杭柏林等[30]学者发现，贝莱斯芽孢杆菌在一定程度上可以代替饲用抗生素的使用，具有良好的应用价值。而在肉仔鸡生产中使用抗菌肽、复合酸化剂可以显著增强体液免疫，改善肠道形态健康，提高肉仔鸡生长性能、营养物质代谢率[31-32]。贝莱斯芽孢杆菌作为益生菌具有很大的开发潜力，可以减少抗生素对动物和环境的危害，并有可能在未来取代抗生素成为一种新药[32]。研究同样证明，贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1 制备的代谢物制剂对罗曼灰商品蛋鸡具有良好的促生产作用，与前人研究的结果一致。

4 结论

本试验结果表明，贝莱斯芽孢杆菌BzAH-1 的抗菌代谢物质的添加提高了蛋鸡的生产性能，不仅能够提高产蛋率，减少了烂蛋和畸形蛋的产生，同时也降低了死亡率，达到了良好的生产应用效果。