刘洋,李国辉,曹晓念,赵旭冬,敖宗华,钟其顶,沈才洪,5
1(国家市场监管技术创新中心(轻工消费品质质量安全),北京,100015)2(中国食品发酵工业研究院有限公司,北京,100015)3(中轻技术创新中心有限公司,北京,100015)4(泸州老窖股份有限公司,四川 泸州,646000)5(国家固态酿造工程技术研究中心,四川 泸州,646000)
茶和酒是我国两大传统经典饮料,其各自风味变化精妙,茶、酒融合更是增添了茶酒风味特色。茶的含蓄内敛和酒的热情奔放同时呈现,但茶、酒风味融合过程中度的把握必须准确,方得完美协调[1]。为尽可能地反映和表征酒类的挥发性组分和整体香气特征,研究者通常结合多种处理方法以互相补充完善[2]。常见的前处理方法有直接进样、液液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE)、液液微萃取法、固相萃取法、固相微萃取法、顶空固相微萃取法(headspace solid-phase micro-extraction, HS-SPME)、搅拌棒吸附萃取法和超临界流体萃取法等。其中,最为常用的是LLE和HS-SPME,前处理方法不同则鉴定出的化合物也有一定偏差,研究表明,LLE法对醇类物质敏感,能够较为容易地提取到酒中大部分挥发性化合物,且对目标化合物有富集作用,HS-SPME法不需要溶剂进行萃取,操作简单快捷,能萃取到更加丰富的酯类和酸类物质,甚至可以检测到高沸点挥发性物质,能够最大程度保留样品的挥发性组分,灵敏度和重现性较高[3-4]。对于茶酒风味组分的测定,一般采用LLE和HS-SPME结合GC-MS进行分析。李朝云[5]和王晓娜等[6]利用GC-MS技术检测到茶酒主要的特征香气物质120余种,但传统的一维色谱分离技术峰容量有限,很难满足茶酒复杂的风味组分分析要求。
全二维气相色谱-飞行时间质谱联用(comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry,GC×GC-TOF/MS)作为一种新兴的色谱分离技术,使用一个调制器将分离机理不同又相互独立的2根不同固定相的色谱柱串联,实现了将不同沸点和不同极性组分的正交分离,增强了色谱系统分析能力,具有峰容量大、分辨率高、族分离等特点,在复杂样品全组分分析方面具有显著优势[7]。目前,GC×GC-TOF/MS已应用于测定酱油、食用油和酱香型、清香型及各类白酒的挥发性组分分析[8-9],但在茶酒及其香气组分方面的GC×GC-TOF/MS研究报道较少,本研究采用LLE和HS-SPME结合GC×GC-TOF/MS技术分析茶酒及其基酒的挥发性组分,有助于明确茶酒挥发性组分体系,为茶、酒的风味融合研究提供科学支撑。
样品:茶酒(酒精度40.8%)及其基酒(酒精度53%),泸州老窖养生酒业有限责任公司生产并提供。
NaCl、二氯甲烷、Na2SO4,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;超纯水(电阻率≥18.2 MΩ·cm),美国Millipore公司Milli-Q纯水仪制备;SPME Arrow系列ARR11-DVB/CWR120/20 (1.1 mm DVB/CWR/PDMS)三相箭形固相微萃取头,广州智达实验室科技有限公司。
GC×GC-TOF/MS主要包括:Agilent 7890 GC气相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司;SSM 100固态调制器、EI-TOF/MS 0620电子轰击源飞行时间质谱仪,广州禾信仪器股份有限公司;PAL RTC自动进样系统,广州智达实验室科技有限公司;SHB-循环式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;氮吹仪,北京帅恩科技有限责任公司。
1.3.1 样品前处理方法
1.3.1.1 HS-SPME法
取酒样2.0 mL置于20 mL顶空瓶,加超纯水稀释酒精度至10%(体积分数)后加入3.5 g NaCl至饱和,用PTFE/硅橡胶垫片铝盖密封,通过DVB/CWR/PDMS三相箭形固相微萃取头进行SPME萃取。样品预孵化时间10 min,预孵化振摇速度450 r/min,预孵化加热温度50 ℃;萃取头于240 ℃下老化10 min,穿过密封垫于顶空瓶上部顶空处,50 ℃下吸附萃取30 min,萃取振摇速度450 r/min;萃取结束后插入气相进样口脱附180 s。
1.3.1.2 LLE法
取酒样10.0 mL,用超纯水稀释至酒精度为10%(体积分数),加入15 g NaCl至饱和后加入到分液漏斗,用二氯甲烷萃取(20 mL×3次),合并有机相,加适量Na2SO4除水,并于-20 ℃冰箱过夜,提取液经旋蒸和氮吹使其浓缩至0.5 mL,经0.22 μm孔径滤膜过滤待测,进样体积为1 μL。
1.3.2 仪器分析方法
色谱条件:一维色谱柱ZB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm)和二维色谱柱DB-17HT(0.6 m×0.25 mm×0.15 μm)通过固态热调制器串联。升温程序:初始温度40 ℃,保持5 min,以3 ℃/min的速率升至250 ℃,保持5 min。调制器调制周期5 s,热调制时间1 s,入口温度70 ℃,冷肼温度9 ℃,出口温度160 ℃。以He为载气,载气流速1 mL/min,进样口温度260 ℃,分流比20∶1,分流流量20 mL/min。
质谱条件:电子轰击离子源电压70 eV,离子源温度230 ℃,接口温度240 ℃,以101 spestra/s速率进行采集,扫描范围m/z35~500。
1.3.3 化合物鉴定方法
GC×GC-TOF/MS采集的数据经过Canvas全二维色谱数据处理工作站进行数据处理,自动识别信噪比大于50的化合物,色谱图自动积分解卷积和质谱库NIST 17比对。为保证鉴定结果可靠,筛选3个平行样中出现2次的化合物,经人工解析对比质谱碎片,选择匹配度最高且正反相似度均大于700的化合物作为初步鉴定结果,导出峰表。利用数据处理软件,剔除柱流失以及含硅烷类物质,合并重复化合物后作为最终鉴定结果。以相对峰面积法进行定量分析,某组分相对含量为该物质峰面积占所有挥发性组分总峰面积的百分比。
茶酒及其基酒的挥发性组分较为复杂,传统的一维气相色谱质谱联用技术难以分离痕量化合物并准确鉴定该样品的色谱峰。在二维气相色谱中,一维长色谱柱和二维短色谱柱分别是非极性色谱柱和极性或中等极性色谱柱,能够使化合物先按照沸点进行分离,在调制器聚焦后全部进入二维色谱柱,根据极性的不同再次分离,二维信息实现正交分离后进入高分辨的质谱进行高通量分析,从而获得复杂化合物组成的二维和三维图谱。GC×GC-TOF/MS分析茶酒和基酒挥发性组分的二维和三维色谱图如图1所示,各挥发性组分分离度良好。
a-茶酒2D色谱图;b-基酒2D色谱图;c-茶酒3D色谱图;d-基酒3D色谱图
基于GC×GC-TOF/MS技术,采用HS-SPME法在茶酒和基酒中分别分离检测到1 483和1 265个色谱峰,采用LLE法在茶酒和基酒分别检出1 978和1 360个色谱峰。通过定性分析,在茶酒和基酒中鉴定出的挥发性组分统计结果见表1,组分交叉结果见图2。
表1 茶酒及基酒中各类挥发性组分鉴定结果
图2 LLE法和HS-SPME法提取的茶酒及基酒挥发性组分异同
通过不同前处理方法分析的茶酒和基酒挥发性组分统计对比可知,LLE和HS-SPME对于化合物的提取和富集能力存在明显差异,也反映了茶酒中挥发性组分的多样性。通过HS-SPME法和LLE法分别鉴定出茶酒中挥发性化合物212种和262种,基酒中挥发性化合物分别为165种和110种。结果表明,在茶酒中,LLE比SPME法富集到的醇类、酸类更多;相比于LLE法,HS-SPME法对酯类更敏感,在茶酒和基酒中能够富集到的酯类化合物更加丰富。
本研究共鉴定出茶酒中挥发性组分366种,多于已报道的茶酒中挥发性组分种类[6,10],其基酒挥发性组分220种。其中,茶酒及其基酒中共同检出的化合物有171种,表明茶酒含有基酒主要的挥发性组分特征;基酒中独有的组分有49种,茶酒中独有的组分有193种,充分体现了茶、酒的风味特征在茶酒中的有机融合。
2.3.1 茶酒中酯类组分
2种酒样中酯类最丰富且含量最高,茶酒中检出酯类组分含量结果见电子增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033704)。茶酒和基酒共有的酯类为78种,相对含量较高的有乙酸乙酯、异丁酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、棕榈酸乙酯。其中,茶酒中己酸乙酯和乙酸乙酯相对含量分别为14.691%(LLE)和3.008%(HS-SPME),会影响茶酒的果香及甜香[11-12];癸酸乙酯和肉豆蔻酸乙酯呈现苦涩味,乙酸异戊酯和辛酸异戊酯具有花果香,月桂酸乙酯具有香脂香和蜜香,棕榈酸乙酯具有苹果香和菠萝香[5,13],这些酯类含量较低但其独特的香味在茶酒风味中发挥不可替代的作用。
茶酒中单独检出的酯类化合物包括丙位辛内酯、γ-壬内酯、γ-戊内酯、γ-丁内酯、δ-己醇内酯、α-当归内酯等内酯类化合物,以及2-羟基正丁酸乙酯、2-辛烯酸乙酯、富马酸二乙酯、(±)-α-甲氧基-苯乙酸甲酯、棕榈酸甲酯、水杨酸甲酯等。棕榈酸甲酯、α-当归内酯和水杨酸甲酯等微量健康成分同时也是茶叶的特征挥发性组分[6,14],可使茶酒酒体滋味丰富,赋予茶酒不同于常见各类香型酒的风味特征。
2.3.2 茶酒中醇类和酸类组分
本研究在茶酒和基酒中分别鉴定出39种和23种醇类组分,其中共有醇类14种。除乙醇外,2-丁醇、1-丙醇、正丁醇、戊醇等相对含量均在0.100%(HS-SPME,LLE)以上,是茶酒和基酒的醇类骨架成分,其中正丁醇、异丁醇和异戊醇均呈现一定的苦味和涩味[15]。茶酒中醇类和酸类组分分析结果见增强出版附表2,分析结果显示,茶酒中含有丰富的多元醇类,如DL-2,3-丁二醇、三甘醇、四甘醇、五甘醇等,在基酒中并未检出。酒中的多元醇类一般来源于酵母菌通过埃利希代谢途径等微生物发酵过程,将糖和氨基酸等转化得到。多元醇的黏稠状态赋予了白酒酒体醇厚口味绵长的特点,并且是白酒甜味的主要来源[16]。雷钧等[17]通过高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术分析浓香型白酒中多元醇,结果表明浓香型白酒的窖池底部黄水、蒸馏尾水及成品酒各段过程样均有戊五醇和己六醇的存在,证明浓香型白酒中的多元醇来自于酿酒自然发酵过程。此外,茶酒中含有6-十一醇、2-十二烷醇、3-十五烷醇等长链醇在基酒中也均未检出,说明在茶酒中长链醇类化合物的种类和含量有所增加,可能会影响茶酒的苦涩味。
茶酒中检出的酸类组分有30种,占所有挥发性组分的5.281%(HS-SPME),基酒中检出酸类组分22种。2种酒样中均有检出的酸及酸酐类化合物共20种,含量较高的有丁酸、异戊酸、戊酸、异丁酸、棕榈酸、己酸、庚酸、辛酸。有机酸是白酒主要的呈酸物质,适量酸类会使酒体醇厚丰满[18]。在茶酒中,酸类含量最高的是己酸(2.333%,HS-SPME),其次是辛酸(0.773%,HS-SPME)、丁酸(0.701%,HS-SPME),符合该茶酒以浓香型白酒作为基酒的风味特点[19]。
2.3.3 茶酒中醛酮类组分
本研究发现茶酒中含有多种醛酮类组分,见增强出版附表3,茶酒和基酒中共检出的醛酮类有23种,其中在茶酒中含量较高的醛类组分有乙缩醛二乙醇(1.141%,HS-SPME)、乙醛(0.281%,HS-SPME)、异戊醛(0.134%,LLE)和乙氧基乙醛二乙缩醛(0.121%,LLE)等。含量较高的酮类组分有仲辛酮(0.071%,HS-SPME)、丙酮(2.544%,LLE)、2-戊酮(0.032%,HS-SPME)、2-壬酮(0.035%,HS-SPME)等。其中,2-戊酮和2-壬酮具有甜香和水果香,后者香气阈值483 μg/L[20],可能是影响茶酒风味的重要化合物之一。
缩醛类化合物是由于醇和醛在过量的情况下反应生成,茶酒和基酒共同检出乙缩醛二乙醇、二乙醇缩甲醛、丁醛二乙缩醛、庚醛二乙缩醛、壬醛二乙缩醛和苯甲醛二乙缩醛等;在茶酒中还检出3-戊烯-2-酮、4-壬酮、4-十一酮、3,5,5-三甲基环己-2-烯酮等独有的酮类组分,在茶酒研究中鲜有报道。
2.3.4 茶酒中呋喃类组分
呋喃类化合物是一类含氧五元杂环化合物,分子结构上含有一个环二烯醚的结构,大多具有抗癌和抗氧化活性。本研究利用GC×GC-TOF/MS技术在茶酒中鉴定出16种呋喃类化合物,含量较高的有2-糠酸乙酯、糠醛、糠基乙醚、己酸糠酯等相对含量如表2所示。其中,糠醛相对含量最高(0.120%,HS-SPME),有类似苯甲醛的特殊气味,呈现焦苦味;2-糠醛缩二乙醇相对含量较高(0.243%,LLE),对茶酒的酒体和风味具有重要影响;5-甲基-2-乙酰基呋喃(0.007%,LLE)具有甜香、坚果、霉香和焦糖样香气,有干草、香豆素的香韵[21]。2-乙酰基呋喃(0.006%,LLE)呈焦糖和甜香,在咖啡中属于香气骨架成分[12];5-羟甲基糠醛含量较低(0.007%,LLE),但已有研究证明其具有抑制肿瘤、改善血液流变学、降低血液胆固醇等作用[22]。
表2 基于GC×GC-TOF/MS鉴定的茶酒呋喃类组分
2.3.5 茶酒中吡嗪类组分
吡嗪又称对二氮杂苯,是一类含2个氮原子的六元杂环化合物,由酿酒原料和大曲中的氨基酸或氨基化合物与还原糖之间发生美拉德反应生成,茅台、剑南春、汾酒、老白干等白酒中均有丰富的吡嗪类化合物[23]。目前白酒中已发现25种吡嗪类化合物[3],其中酱香型白酒中吡嗪种类最丰富且含量可达3 000~6 000 μg/L,浓香型白酒中吡嗪类化合物含量约为500~1 500 μg/L,吡嗪类化合物是白酒中关注度较高的一类健康因子,具有较强的抗氧化能力及抗炎作用[24]。
茶酒中检出6种吡嗪类组分,相对含量见表3。其中,2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪是浓香型白酒中常见的化合物,3,5-二乙基-2-甲基吡嗪是酱香型白酒中较为丰富的吡嗪类[3]。四甲基吡嗪又称川芎嗪,作为酒类关注度较高的含氮类化合物,最初是在中草药中发现,后来研究证明也存在于白酒中[24]。四甲基吡嗪呈现焙烤香气,由美拉德反应的中间体丁二酮与蛋白质水解的氨基酸发生缩合反应生成,其具有一定的生物活性,如保肝、护肝、改善高血糖和抗氧化等健康作用[25]。因此,茶酒中四甲基吡嗪等吡嗪类组分的存在不仅影响着茶酒的风味和品质,也对茶酒的健康属性具有重要意义。
表3 基于GC×GC-TOF/MS鉴定的茶酒吡嗪类组分
2.3.6 茶酒中萜烯类组分
萜烯是一类链状或环状烯烃类的天然有机化合物,可根据异戊二烯单位的数量不同分为半萜、单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜等;而大多数萜类都是含氧衍生物,则又可以分为萜醇、萜醛、萜酮、萜酸和萜酯等[26]。萜烯类化合物主要来源于酿酒原料和微生物代谢。在白酒固态发酵过程中,一些原料和底物会在微生物的作用下产生碳原子迁移和骨架重排生成萜烯类化合物。
本研究在茶酒中共发现7种萜烯类组分(表4),包括茶叶香气的代表成分芳樟醇和橙花醇[5],其中,芳樟醇(0.01%,LLE)含量最高,属于非环单萜醇;橙花醇(0.001%,LLE)属于链状单萜类,具有一定的花香。α-萜品醇属于环状单萜类,是清香绿茶的关键香气成分之一,香叶基丙酮是一种无环萜类[27];本研究还检出了α-姜黄烯和石竹醇,其本身是茶叶的重要活性成分[28],融合到茶酒中为茶酒带来独特风味和健康属性。
表4 基于GC×GC-TOF/MS鉴定的茶酒萜烯类组分
茶与酒的风味如何在茶、酒风味融合产品的生产中契合是十分重要的技术难点,精准控制茶的风味元素与酒的风味元素对于产品最终风格形态具有决定性的作用。本研究采用GC×GC-TOF/MS技术结合HS-SPME和LLE法首次全面解析了茶酒的挥发性组分,实现了茶酒复杂组分的高通量筛查和分析。在茶酒和基酒中分别鉴定出挥发性组分366种和220种,对比了茶酒和基酒中共同检出的组分与茶酒中独有的挥发性特征组分。同时,在茶酒中检出了2-糠酸乙酯、糠醇、2-糠醛缩二乙醇等呋喃类,2-乙基-5-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等吡嗪类,以及α-姜黄烯和石竹醇等多种微量健康因子。本研究为进一步深入探究茶、酒风味融合以及茶酒饮用舒适性提供了分析手段与物质基础。