毛霉型腐乳发酵菌株筛选和人工接种发酵腐乳感官品质评价

苏彬,任璐,张玉,宋佳佳,王晨,王洪伟*,索化夷*

1(西南大学 食品科学学院,重庆,400715)2(川渝共建特色食品重庆市重点实验室,重庆,400715)

腐乳在中国有着悠久的历史,早在魏朝(公元386—534年)就有了对腐乳制作的记录[1]。传统腐乳以自然发酵的方式进行生产,主要包括制作豆腐、压块、切割、自然接种、前发酵、加辅料、后发酵等过程[2]。传统发酵制曲过程参与多种微生物,腐乳风味浓郁,但同时由于涉及到大量的环境微生物,导致产品的品质和安全性不可控[3]。由于人工接种发酵安全性更高[4],品质更好控制,近年来已应用于酸笋[5]、泡菜[4]、水豆豉[6]等发酵产品。但是人工接种发酵食品的风味不及传统发酵食品,为腐乳的工业化生产带来了难题。腐乳感官评价体系构建和优良发酵菌株的筛选是关键解决途径。

毛霉型腐乳发酵过程涉及多种微生物,其主要制曲菌种为雅致放射毛霉。细菌群落主要为不动杆菌(Acinetobacte)、肠球菌(Enterococcus)和链球菌(Streptococcus)。对于真菌群落,腐乳毛坯以丝孢酵母(Trichosporon)和放射菌(Radiomycetes)为主,腌坯过程曲霉(Aspergillus)和丝孢酵母占主要优势[7]。雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)能分泌多种酶,将大豆中的蛋白质、脂质和碳水化合物水解成氨基酸和小分子,对品质形成有重要贡献,是主要的腐乳发酵菌种[8]。目前,根据蛋白酶活力等指标,已筛选出雅致放射毛霉 MGC317[9]、雅致放射毛霉WL3.006[10]作为腐乳的发酵菌株,但是与传统发酵腐乳相比,这些腐乳的品质如何研究较少。

腐乳应具有润滑细腻的口感、咸鲜的滋味和浓厚的香气[11]。氨基酸是一类具有味感的物质,可经代谢转化后变成挥发性风味成分,游离氨基酸含量对腐乳的滋味有着重要影响[12]。顶空固相微萃取(head space solid-phase micro-extraction,HS-SPME)结合GC-MS进行分析被广泛用于检测腐乳中的挥发性化合物[8]。但仅用仪器分析,则无法预测人类感知到的整体风味,感官评价作为一种可靠的方法,被用来表征腐乳的风味特征[13]。偏最小二乘回归(partial least-squares regression,PLSR)是将自变量和因变量分别进行线性组合分析,再将求得的数据进行关联分析的统计学方法,在筛选关键风味物质上具有广泛的应用。目前结合感官评价与仪器分析,PLSR阐明了4-甲氧基苯酚、苯酚、愈创木酚等酚类化合物是腊肉产生烟熏风味的关键物质[14]。PLSR剖析了正丁醇、苯乙酸乙酯、戊酸、己酸、己酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯是白酒的关键风味物质[15]。将仪器分析和感官定量描述分析相结合使我们可以更好地比较产品风味品质。

本研究根据菌株生长量、蛋白酶和脂肪酶活力,筛选出具有良好发酵性能的雅致放射毛霉CJ-6。其次将人工接种CJ-6发酵的腐乳与传统发酵腐乳的感官特征和挥发性物质进行比较,确定人工接种发酵腐乳与传统发酵腐乳具有相似的风味特征。然后利用GC-MS检测腐乳中的挥发性物质。并结合香气活性值(odor activity value,OAV)和PLSR探讨雅致放射毛霉CJ-6对腐乳风味特征的影响及其机制。最后探究人工接种CJ-6腐乳发酵过程中硬度、弹性和游离氨基酸含量的变化,评估其口感和滋味。旨在为现代腐乳工业中发酵菌株的选择、生产工艺和风味的改进提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株:所用菌株皆为雅致放射毛霉,其中RY-1、RY-2和RY-3购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC),菌株编号分别为CICC 40701、CICC 41043、CICC 41355。CY-4、CY-5和CJ-6是从市售腐乳中分离所得。并且CJ-6中不存在与真菌毒素合成相关的PKS 及 PKS-NRPS 混合代谢合成的相关基因及代谢途径。

4种传统发酵腐乳S1、S2、S3、S4,市售;S5为人工接种CJ-6发酵腐乳。

试剂:邻二氯苯标准品、福林酚,北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2F超净工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;GCMS-QP2010气相色谱质谱联用仪,日本岛津公司;DB5-MS气相毛细管柱,美国Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头,美国Supelco公司;CT-3质构仪,美国Brookfield公司;L-8900011001全自动氨基酸分析仪,日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株生长量的测定

参考陈菽等[16]的方法,略作修改。取2 mL 5×106个/mL孢子悬浮液加入250 mL 锥形瓶中,180 r/min振荡培养,每隔12 h取发酵液,用已知重量的滤纸过滤,水洗2次后一起于105 ℃的烘箱烘至恒重,称重,计算可得菌株生长量。

1.3.2 菌株酶活力的测定

粗酶液的制备:准备5 g样品,加入15 mL缓冲液,高速匀浆机打碎后置于40 ℃水浴锅中60 min,定容至100 mL,纱布过滤后滤液4 000 r/min离心10 min,上清液为待测酶液。

福林酚法[17]测定蛋白酶活力,将40 ℃下,1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位(U/g)。

PVA-橄榄油乳化液水解滴定法[17]测定脂肪酶活力,在40 ℃下,1 min水解底物产生1 μmol脂肪酸定义为1个脂肪酶活力单位(U/g)。

1.3.3 腐乳的制作

参考CHOU等[18]的方法,略作修改。豆腐切成2.5 cm×2 cm×2.5 cm大小,按10%(体积分数)的接种量接种雅致放射毛霉CJ-6孢子悬浮液(5×106个/mL),进行前发酵;搓毛后,加入10%(质量分数,下同)食盐,在25 ℃下腌制2 d;然后加入10%的盐水没过样品,在同样的条件下腌制3 d;再用10%的盐水冲洗腌制好的豆腐2～3次,沥干水分;装罐,加入辅料[10%的盐和12%(体积分数)的白酒],封罐,25 ℃发酵。

1.3.4 感官评价

参考周柬等[19]的方法进行感官评价,略作修改。感官评价小组经过120 h感官培训,参加过豆豉[19]、腊肉[14]、酸奶[20]等感官评价实验。参考CHEN等[13]的方法确定感官描述词,将腐乳感官描述词、参比样及3位随机数字编码的腐乳样品呈递给感官评价人员。感官评价人员以15点尺度对样品进行评价,增量为0.5,其中0表示“无”,15表示“极高”。试验数据使用云智能感官评价系统https://www.cloudsensorylab.com收集。

1.3.5 挥发性物质测定[11]

样品准备:称取腐乳样品3 g加入20 mL顶空进样瓶中,添加3 μL 内标(100 μg/mL的邻二氯苯溶液)。用聚四氟乙烯隔垫密封。60 ℃下保温平衡10 min后,插入DVB/CAR/PDMS萃取头, 完全伸出萃取头距液面上方0.5 cm处,在60 ℃下萃取40 min,萃取结束后在GC 进样口(250 ℃)解析5 min。

色谱条件:DB5-MS毛细管柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm);进样口温度为250 ℃;载气为高纯氦气(≥99.999%);载气流速为1.0 mL/min;不分流方式进样;40 ℃保持5 min后以4 ℃/min升至130 ℃,保持1 min后以10 ℃/min升至220 ℃并保持5 min。

质谱条件:离子源230 ℃,接口250 ℃,电离方式为电子电离(EI)源;电子能量70 eV;质量扫描范围30～500m/z。

根据NIST14数据库检索对化合物进行定性分析,根据内标法对化合物进行半定量分析的方法。含量按公式(1)计算:

(1)

式中:Ci,未知化合物含量,ng/g;Si,未知化合物峰面积;S,内标物峰面积;ρ,内标物浓度,μg/mL;V,内标物体积,μL;m,样品质量,g。

1.3.6 OAV的计算

OAV按公式(2)计算:

(2)

式中:Ci,化合物的含量,ng/g;OTi,查询所得的化合物的香气阈值,ng/g。

1.3.7 质构特性测定

质构特性的测定参考蒋丽婷等[21]的方法,略作修改。取白坯、毛坯、盐坯、发酵10 d、发酵20 d、发酵40 d和成品(发酵60 d)样品,采用质地剖面分析(texture profile analysis,TPA)模式,利用质构仪检测探头二次下压测定硬度和弹性。

测定参数:探头型号TA4/1000,测前探头下压速度1.5 mm/s,测试速度1.0 mm/s,测厚探头回程速度1.5 mm/s,压缩比例30%,触发力2 g。

1.3.8 游离氨基酸测定

参考索化夷等[22]的方法测定。准确取白坯、毛坯、盐坯、发酵10 d、发酵20 d、发酵40 d和成品(发酵60 d)的样品100 mg,加入9 mL 4 g/100 mL磺基水杨酸溶液振荡摇匀,于4 ℃冰箱静置 24 h,16 000 r/min 离心5 min。上清液过膜(0.45 μm),用全自动氨基酸分析仪测定。

1.3.9 数据分析

使用Origin 2018软件绘制雷达图,使用XLSTAT 2019.2.2进行主成分分析(principal component analysis,PCA)、层次聚类分析法(agglomerative hierarchical clustering, AHC)、PSLR分析。

2 结果与分析

2.1 六株菌发酵性能比较

2.1.1 菌株生长量

在工业生产中,使用生长能力强的菌株作为发酵剂可以缩短发酵周期、提高效率。菌株生长量如图1-a所示。CJ-6和RY-1在0～36 h生长速度高于其他4株毛霉,且在36 h达到最大生长量,分别为(0.455±0.040)、(0.416±0.043) g,CJ-6生长速度最快。

a-菌株生长量;b-菌株蛋白酶活力;c-菌株脂肪酶活力

2.1.2 菌株蛋白酶活力

在腐乳发酵过程中,大豆中蛋白质的水解程度对腐乳风味、口感和质地有着重要影响[9]。菌株蛋白酶活力如图1-b所示。酶合成在0～48 h迅速增加,在达到最大活性后逐渐减少。在CJ-6中观察到蛋白酶活力增长最快且有最高的酶活力(310.564±5.383)U/g。童佳[23]认为蛋白酶是酱油风味形成的关键酶,能将大豆中的蛋白质降解为氨基酸、多肽等[24],对风味及滋味有着重要作用。陈怡等[25]将蛋白酶活力作为选择浏阳豆豉发酵菌株的重要指标。选择蛋白酶活力高的菌株,对于提高发酵豆制品的风味质量具有重要意义。

2.1.3 菌株脂肪酶活力

在腐乳发酵过程中,脂肪酶将脂肪分解为甘油和脂肪酸,然后进一步转化为有机酸,这些有机酸与醇反应形成的酯,对腐乳的风味形成起着重要作用[24]。菌株脂肪酶活力如图1-c所示。大多数菌株的脂肪酶产量在0～60 h迅速增加,然后逐渐下降。CJ-6的脂肪酶活力最强,最高酶活力为(15.970±0.342)U/g。CJ-6在6株雅致放射毛霉中,生长旺盛,有最高的蛋白酶和脂肪酶活力,表明CJ-6具有作为腐乳发酵菌株的潜力。

2.2 人工接种CJ-6对腐乳风味的影响

2.2.1 感官评价

参考CHEN等[13]的方法,略作修改,增加了鲜香、辣椒香、甜香、酸香和刺激5个描述词,如表1所示。对5种腐乳进行定量描述性分析(quantitative descriptive analysis, QDA),结果如图2所示,5种腐乳在酒香、辣椒、霉味属性上有显著差异(P<0.05)。

表1 腐乳香气特征、定义及参比样

图2 腐乳感官结果雷达图

对QDA结果进行PCA,如图3所示。PC1和PC2解释了总体变异的79.32%(50.96% PC1;28.35% PC2)。S1和S5与发酵豆味、油香、霉味、咸香、刺激关联紧密。通过AHC分析(图4),腐乳分为3类,第一类包括S1和S5,它们具有最低的相似性指数,表明它们具有较高的相似性。第二类包含S3和S4。第三类仅包含S2,其总体差异指数最高。PCA和AHC结果一致,说明S1和S5具有相似性。

图3 腐乳感官属性的PCA图

图4 腐乳样品的AHC图

2.2.2 挥发性物质分析

2.2.2.1 挥发性物质含量差异

使用HS-SPME-GC-MS在5种腐乳中检测到了70种化合物,如电子增强出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033651)。主要包括10种醇类,28种酯类,6种醛类,5种吡嗪,5种萜烯类和 5种酮类。在S1、S2、S3、S4和S5中分别鉴定出了42、32、34、25和29种化合物。OAV>1的化合物被认为对整体风味有贡献[8],且挥发性物质的OAV值越大说明该化合物对整体香气的贡献越大。在70个化合物中,OAV>1的挥发性化合物有1-辛烯-3-醇、苯酚、苯乙醛、2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、苯乙醇、辛酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、2-正戊基呋喃、己酸乙酯、丁酸乙酯、丁香酚、芳樟醇和2-甲基丁酸乙酯共13种,如附表1所示。S1、S2、S3、S4、S5分别占6、6、8、5、7种。

辛酸乙酯和己酸乙酯是4种传统腐乳中OAV>1的挥发性物质,分别具有类似白兰地的香气和水果香气[26],同时辛酸乙酯也在S5中检出。丁香酚和2-甲基丁酸乙酯分别是S3独有的挥发性物质,芳樟醇是S1独有的挥发性物质。不同腐乳挥发性物质的不同可能与发酵菌株、生产环境有关。除此之外,1-辛烯-3-醇和苯乙醛是S1和S5的OAV>1的挥发性物质。1-辛烯-3-醇是豆浆的关键风味物质,呈蘑菇味和霉味,或许是S1和S5霉味突出的重要因素。苯乙醛是一种脂肪醛,具有花香、甜味和生青味,广泛存在于发酵大豆产品中[27],对S1和S5的风味有重要贡献。3-苯丙酸乙酯、苯酚和苯乙醇是腐乳中常见的风味物质[26],对S2、S3和S5的风味形成有着较大影响。同时,2-乙基-6-甲基吡嗪具有坚果味[28],在S5中含量最高。丁酸乙酯和2-正戊基呋喃分别具有强烈的苹果香味[8]和绿豆、黄油味,在与其他风味物质的共同作用下对腐乳的香气带来积极影响。

2.2.2.2 PLSR分析

以5种腐乳中OAV>1的13种挥发性物质为自变量,以QDA法得到感官强度为因变量,进行PLSR分析,如图5所示,前两个主成分解释了70.56%的交叉验证方程。S1和S5相距较近,与发酵豆味、刺激、油香、咸香等感官属性联系密切,并与苯乙醇、辛酸乙酯、苯酚、3-苯丙酸乙酯、苯乙醛等挥发性物质相关。S3具有甜香、酸香和酒香属性,与2-甲基丁酸乙酯和丁香酚高度相关。

图5 腐乳的感官属性、挥发性物质的PLSR图

2.3 人工接种CJ-6腐乳发酵过程中质构特性和游离氨基酸含量的变化

2.3.1 人工接种CJ-6腐乳发酵过程中质构特性

腐乳发酵过程中硬度的变化,见电子增强出版附图1-a(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033651)。总体来说,随着发酵时间的延长,硬度逐渐下降至(142±13.65)g。在毛坯阶段的硬度略有升高,这可能是由于在毛坯阶段,菌丝大量生长,形成致密的菌丝包裹住豆腐。随着发酵时间的延长,汤汁逐渐渗透到坯体中,同时微生物产生的酶将豆腐中的蛋白质分解,蛋白质空间结构被破坏,使得坯体变软,硬度逐渐下降[11]。

腐乳发酵过程中弹性的变化,见电子增强出版附图1-b(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033651)。随着发酵时间的增加,S5的弹性逐渐降低至(3.56±0.17)mm。发酵40 d后,样品的弹性逐渐趋于稳定。这可能是因为在多种酶的作用下,蛋白质的凝胶结构被破坏,使得坯体的弹性逐渐下降,当酶解反应基本完成,坯体的弹性趋于稳定[11]。

随着发酵的进行,各种微生物分解蛋白质、淀粉等物质,越到后期,硬度和弹性越小,但这也使腐乳的质地更加润滑,口感更佳细腻。

2.3.2 人工接种CJ-6腐乳发酵过程中游离氨基酸含量的变化

游离氨基酸对腐乳滋味的形成具有重要作用[22]。在腐乳发酵过程中,共检测出17种氨基酸,见电子增强出版附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033651)。经过发酵后,白坯中的氨基酸总量明显提高,由最初的2.551 mg/g增加到15.141 mg/g,增加了约5.94倍;同时增加了赖氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸和亮氨酸4种必需氨基酸,这表明CJ-6发酵可以改善豆腐滋味和营养。根据张建萍等[29]对滋味的描述,将氨基酸分为甜味氨基酸(苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸)、苦味氨基酸(缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、精氨酸)、鲜味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和无味氨基酸(半胱氨酸、赖氨酸、脯氨酸)。在腐乳成品中,谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸含量占主导,占总量的51.16%。其中谷氨酸和亮氨酸的含量最大,是大豆发酵食品中主要游离氨基酸[22]。S5成品中甜味、苦味和鲜味氨基酸分别占游离氨基酸总量的17.36%、38.21%、22.37%,但在腐乳中,并没有感觉到明显的苦味,腐乳主要表现为鲜味和咸味。咸味可能与食盐较高的添加量有关。S5游离氨基酸中谷氨酸含量高达2.907 mg/g,同时谷氨酸在酸性条件下可以与钠离子结合形成鲜味浓郁的谷氨酸钠,鲜味特征得到加强,从而掩盖了苦味特征[22]。各种游离氨基酸相互作用,赋予腐乳独特的滋味。

3 结论

雅致放射毛霉CJ-6有作为腐乳发酵菌株的潜力。在6株雅致放射毛霉中,CJ-6具有最快的生长速度,在36 h达到最大生长量(0.455±0.040)g,比CY-5的最大生长量高(0.153±0.029)g;CJ-6的蛋白酶活力在60 h达到最强,为(310.564±5.383)U/g,比RY-1、RY-2、RY-3、CY-4和CY-5的最大蛋白酶活力分别高出(14.864±0.971)、(32.154±3.403)、(109.214±2.385)、(53.385±6.753)、(108.3±1.329)U/g;CJ-6的脂肪酶活力在72 h达到最强,为(15.970±0.342) U/g,比RY-1、RY-2、RY-3、CY-4和CY-5的最大脂肪酶活力分别高出(8.800±0.130)、(3.390±0.130)、(2.340±0.116)、(2.300±0.003)、(2.370±0.102)U/g。人工接种CJ-6可以缩短发酵周期、提高效率并保证腐乳的风味。

人工接种发酵腐乳达到与传统发酵腐乳相似感官特征,13种化合物对腐乳风味产生重要影响。对感官评价结果进行PCA和AHC分析,发现S5与传统发酵腐乳S1的感官特征相似,发酵豆味、油香、霉味、咸香、刺激等感官属性突出。利用GC-MS在5种腐乳中共检测出了70种化合物,其中1-辛烯-3-醇、苯酚、苯乙醛、2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、苯乙醇、辛酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、2-正戊基呋喃、己酸乙酯、丁酸乙酯、丁香酚、芳樟醇和2-甲基丁酸乙酯共13种化合物的OAV>1,对腐乳风味的形成起着重要作用。PLSR分析表明苯乙醇、辛酸乙酯、苯酚、3-苯丙酸乙酯、苯乙醛是CJ-6产生的关键风味物质。

综上所述,雅致放射毛霉CJ-6具有良好的生产特性,制得的人工接种发酵腐乳与传统发酵腐乳风味相似,表明雅致放射毛霉CJ-6发酵腐乳有较好的风味。同时人工接种CJ-6可以增加豆腐白坯的营养,并保证腐乳润滑和细腻的口感以及良好的滋味,该菌株可作为腐乳发酵剂,应用于腐乳工业化生产。