双孢菇提取物对三种肉汤的协助减盐效果研究

陈沙，常金翠，孙 敏，冯 涛,

（1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830000；2.上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418）

世界上大部分人钠盐摄入量高于世界卫生组织推荐的每人每天不超过5 g。这种高钠摄入饮食与高血压、肾脏等慢性非传染性疾病的发展直接相关[1−2]。减少食品中钠含量有不同方法，包括直接逐步减盐、使用替代盐和增味剂、以及改变食盐颗粒大小、形貌及其在食品内的空间分布等[3]。与糖、脂肪一样，盐通常也会影响消费者对食品和饮料的偏好。在汤的配方中，盐对口感的影响很大，去除或减少配方中的盐需要产品开发人员重新平衡整个配方。研究者利用适当的化合物来补偿因钠减少而造成的口感质量损失以维持食品的适口性[4]。

双孢菇滋味鲜美，呈味物质丰富，可以赋予烹饪菜肴丰富的口感，被广泛应用于炒菜、炖汤、酱料以及其它调味品中。Kokumi 是一种能增强咸味、鲜味感知，同时带来一种浓厚的、连续的和复杂的综合口感的物质，能增强食品适口性。呈味肽一般是对食品风味具有一定贡献的小分子寡肽类，Kokumi 肽作为一种新型活性肽类物质，具有良好的味觉特性，少量添加便能增强复合溶液或肉汤的基本味觉，在与其他呈味物质相配合时可以引起味觉品尝方面的醇厚感、冲击感、满口感、绵延感、及增强甜咸鲜味感的复杂性[5−6]。刘建彬等[7]发现酵母抽提物中分子量小于1000 u 的寡肽是主要滋味物质，在鸡汤-NaCl 模型溶液中具有增鲜，增加复杂口感及Kokumi 味感增强。张治文[8]、吴阳[9]以双孢菇为原料分离纯化鉴定出了两种Kokumi 肽Gly-Leu-Pro-Asp 和Gly-His-Gly-Asp，验证发现这两种Kokumi 肽有不同程度的增强咸鲜味的浓厚感风味特性。并开发出一种“减盐不减咸”的双孢菇低盐调味酱。现有研究主要针对于鸡汤，而在常喝的骨汤、鱼汤中应用较少。

本研究将超滤得到分子量在3000 Da 以下的双孢菇提取物，应用于鸡汤、骨汤及鱼汤中，定量分析双孢菇提取物对三种肉汤的减盐效果，为提高汤类产品的品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜双孢菇 上海联中食用菌合作社；老母鸡、活鲫鱼、猪筒骨、生姜 沃天百联生活超市；麦芽糊精、谷胱甘肽、硫酸奎宁 上海泰坦科技股份有限公司；谷氨酸钠、无水柠檬酸、蔗糖 食品级，河南万邦实业有限公司；氯化钠 联合利华；甲醇、乙腈 色谱纯，美国TEDIA 公司；甲酸 美国Thermo 公司；氨基酸 标准品，Sigma 公司；合成肽（EYPPLGR、EWVPVTK）购于南京肽谷生物科技有限公司。

50YC16 高压锅 浙江苏泊尔电器有限公司；MSM2013 实验用膜分离装置 上海摩速科学器材有限公司；Milli-Q 超纯水设备 美国Ultra 公司；SD-1500 喷雾干燥机 上海沃迪自动化装备股份有限公司；Agilent1100 高效液相色谱系统 美国安捷伦公司；TS-5000Z 型电子舌 日本INSENT 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 双孢菇提取物制备工艺 根据张治文[8]、吴阳[9]的方法，选择新鲜双孢菇并进行处理：洗净、打成匀浆（料液比：1:2）→高压蒸煮（60 min，50 kPa）→离心（4 ℃，15 min，4000 r/min）→上清液膜过滤（5 μm水相滤膜）→超滤（3000 Da）→加入60%麦芽糊精喷雾干燥→粉末（样品Y）。

1.2.2 三种肉汤的制备 鸡汤：老母鸡去头去脚，切块，加少量生姜去腥，按照料液比1:2 的比例加入去离子水，高压蒸煮50 min，撇去油脂；

骨汤：猪筒骨洗净，加少量生姜去腥，按照料液比1:4 的比例加入去离子水，高压蒸煮50 min，撇去油脂；

鱼汤：鲫鱼洗净，加少量生姜去腥，按照料液比1:4 的比例加入去离子水，煮沸后小火炖煮30 min，撇去油脂。

1.2.3 双孢菇提取物在三种肉汤中的应用效果评价

通过良好的校园文化氛围加强理想信念教育。校园文化建设包括学风、校风、教风建设，良好的学风、校风和教风不仅能提高高职院校的教育教学质量，还能培养学生良好的道德素养和综合素质，所以，高职院校要不断加强“三风”建设，促进学生塑造正确的价值观念和理想信念。高职院校还要将理想信念教育的内容融入到学生活动中，通过专业知识、语言文学、艺术表演等形式，将无形的理论有形有声的表现出来，让学生真切领会到理想信念的重要性和意义。

1.2.3.1 双孢菇提取物与食盐添加量的效果评价根据大量预实验确定以下肉汤的食盐添加量。

鸡汤：以添加0.2%的食盐为对照，添加0.35%的食盐、0.2%的食盐及0.4%的双孢菇提取物粉末样品（编号分别为JTA、JTB、JTC）到鸡汤中，搅拌均匀，以备后续实验。

骨汤：以添加0.2%的食盐为对照，添加0.4%的食盐、0.2%的食盐及0.4%的双孢菇提取物粉末样品（编号分别为GTA、GTB、GTC）到骨汤中，搅拌均匀，以备后续实验。

鱼汤：以添加0.3%的食盐为对照，添加0.45%的食盐、0.3%的食盐及0.4%的双孢菇提取物粉末样品（编号分别为YTA、YTB、YTC）到鱼汤中，搅拌均匀，以备后续实验。

1.2.3.2 双孢菇提取物协助减盐前后描述性感官分析 根据（ISO，8586-2012）[10]成立感官评价小组，参考GB12313-1990 及Ueda 等[11]的感官评定方法进行改进和完善，感官品评小组设置12 名成员（20～28 岁，男女各半）并进行培训。采用0.08%柠檬酸、1%蔗糖、0.01%硫酸奎宁、0.4%氯化钠、0.35%谷氨酸钠的水溶液分别作为酸、甜、苦、咸、鲜味的标准品及采用0.1%谷胱甘肽的鸡汤溶液作为训练各成员的浓厚感。其他滋味属性评价参考西村敏英等[12]《食品科学和生理学中的Koku 味——适口性重要概念的研究进展》一书，对上述不同种类样品的滋味属性进行描述性感官评价，感官评分采用5 分标度法，0 分为该味觉无法被感知，5 分为该味觉特性极强，所有感官评价试验均在上海应用技术大学感官评价室中进行。

1.2.3.3 双孢菇提取物协助减盐前后在三种肉汤中咸味强度评价 利用时间强度感官评价法（Timeintensity，TI）来研究样品中咸味强度随时间的动态变化[13]。根据《感官属性要求时间强度评估标准指南》[14]对12 名感官评价员进行培训，评价员熟悉时间强度感官评价法的整个过程，并对咸味强度的判断进行训练。从评价员饮入15 mL 汤时开始计时，每隔2 s 收集一次咸味强度数据。在饮入后30 s 后结束计时。在此过程中要求评价员对三种肉汤的咸味强度进行评价。

1.2.4 电子舌测定方法 各取60 mL 汤样品（汤样品编号为：JTA、JTB、JTC、GTA、GTB、GTC、YTA、YTB、YTC 共计9 个样品）分别装入电子舌专用烧杯中，置于自动进样分析装置上。样品重复测定3 次，每次采集时间为120 s，每隔1 s 采集一次数据，以最后30 s 数据的平均值作为样品检测1 次的数据。

1.2.6 5′-核苷酸测定方法 参考周敏等[16]方法。前处理方法：分别取5 mL 样品，加入10 mL 80%的甲醇，于25 mL 试管中超声处理1 h，然后定容至50 mL，10000 r/min 离心15 min，过0.22 μm 有机滤膜，等待上样。色谱条件：Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm），流动相A：甲醇/水/H3PO4，5/95/0.05；流动相B：甲醇/水/H3PO4，80/20/0.05；流动相程序：0～5 min，0%B；5～15 min，0～10%B；15～25 min，10%～100%B；25～30 min，100%B；30～40 min，100%～0%B；40～45 min，0%B。流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，259 nm 紫外扫描检测，进样量5 μL。

1.2.7 呈味物质的呈味贡献分析 采用滋味活性值（Taste active value，TAV）评价呈味物质呈味贡献。TAV 表示样品中呈味物质含量与其阈值之比。TAV 大于1 时，表明该物质对呈味有贡献，且数值越大，影响越显著；TAV 小于1 时，认为该物质对呈味贡献较小[17]。

1.2.8 双孢菇提取物中Kokumi 目标肽的感官评价

采用超滤（UF）、凝胶过滤色谱（GFC）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化双孢菇中的呈味肽[18]。利用反向液相色谱分离得到的呈味最强的组分采用液相色谱质谱联用仪（RPLC-MS/MS）进行分离鉴定。鉴定得到肽序列为EYPPLGR（830.4286 Da）、EWVPVTK（857.4647 Da）的两条目标肽。利用固相合成法合成整个肽序列，进一步通过感官实验来验证合成肽的呈味特点。将0.1%的目标肽EYPPLGR、EWVPVTK 添加到1.2.2 的空白鸡汤溶液中。将配制好的鸡汤溶液送至感官小组成员进行描述性感官评价。感官评价方法按照1.2.3.2。

1.3 数据处理

对于统计分析，使用SPSS 26 对数据进行方差分析。结果用平均值±标准差（SD）表示。多重比较采用邓肯检验。P<0.05，差异具有统计学意义。采用Origin 2021 对电子舌数据进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 双孢菇提取物协助减盐在三种肉汤中的应用效果评价分析

2.1.1 双孢菇提取物协助减盐前后在三种肉汤中滋味属性描述性定量感官评价分析 双孢菇提取物协助减盐的三种肉汤中未感知到苦味，其他滋味属性描述如图1 所示。由图1 可知，利用双孢菇提取物协助减盐后，三种肉汤中的咸味、鲜味及厚味强度增长明显。咸味强度在鸡汤中增长量最高，增长了1.5 倍；鲜味及厚味在鱼汤中增长了最高，分别增长了1.4 倍和1.7 倍。双孢菇提取物协助减盐前后在肉汤中咸味、鲜味无显著性差异（P>0.05）。其他滋味也有不同的增强效果，三种肉汤的复杂感增强，减盐效果明显。但其加入会给较为清淡的骨汤带来异味，削弱骨汤本身的味道，肉味、骨髓味减弱，且呈味氨基酸与核苷酸的总体含量低于鸡汤和鱼汤，骨汤中的离子强度高，缓冲效应强，也会导致鲜味咸味增加不明显应用效果不佳[19−20]。双孢菇提取物在鸡汤和鱼汤中应用效果佳，在鱼汤中不仅减盐增鲜还使其整体风味增强，鱼汤更加香甜。

图1 双孢菇提取物协助减盐前后在鸡汤（A）、骨汤（B）、鱼汤（C）中的滋味雷达图Fig.1 Taste radar map of Agaricus bisporus extract in chicken soup (A),bone soup (B) and fishsoup (C) before and after salt reduction

2.1.2 TI 法评价双孢菇提取物协助减盐前后在三种肉汤中咸味强度 通过多次试验，根据试验重现性，结果如图2 所示，在饮入后30 s 后，双孢菇提取物协助减盐前后在三种肉汤中的咸味强度都呈现先上升后下降的趋势。前4 s，减盐前在三种肉汤中的咸味强度要强于减盐后，减盐前后的咸味强度曲线交叉后，减盐后的咸味强度始终高于减盐前；在整体上，双孢菇提取物协助减盐后在三种肉汤中的咸味强度降低速度较慢，而减盐前三种肉汤的咸味强度降低速度较快。咸味在口腔中持续的时间长于减盐前，是因为双孢菇提取物含有Kokumi 肽，在与其他呈味物质相配合可以引起味觉品尝方面的绵延感、增强咸鲜味感的复杂性，缓释、延迟了咸味感知使味感更加持久[8,21−23]。

图2 双孢菇提取物协助减盐前后在鸡汤（A）、骨汤（B）、鱼汤（C）中的咸味强度曲线Fig.2 Salty intensity curve of Agaricus bisporus extract in chicken soup (A),bone soup (B) and fish soup (C) before and after salt reduction

2.2 电子舌分析

本研究使用日本INSENT 公司的味觉分析系统，测量双孢菇协助减盐前后在三种肉汤中的电子舌响应值。其中，酸味、涩味和涩味回味均在无味点以下，故除酸味、涩味和涩味回味外其他的味觉指标均是汤有效的味觉指标（见图3 雷达图）。如图3（A、C、E）可知，三种肉汤雷达图中的味觉特征大体一致，协助减盐后肉汤中咸味、丰富性、苦味回味显著弱于减盐前（P<0.05），但整体介于对照组与减盐前组分之间。对比电子舌与感官评价结果有所差异。分析认为，电子舌是一种智能识别电子系统，部分味觉分辨力和敏感度在一定程度上与人体感官仍存在差异。双孢菇提取物中钠离子含量低，存在呈味肽产生咸味，以至于电子舌无法正确识别咸味。同时，可能存在咸味和鲜味协同效应。

图3 双孢菇提取物协助减盐前后电子舌响应值的雷达图（鸡汤A；骨汤C；鱼汤E）及主成分分析图（鸡汤B；骨汤D；鱼汤F）Fig.3 Radar map of electronic tongue response value before and after salt reduction assisted by Agaricus bisporus extract (chicken soup A;bone soup C;fish soup E) and principal component analysis diagram (chicken soup B;bone soup D;fish soup F)

由图3（B、D、F）可知，双孢菇提取物协助减盐前后在三种肉汤中的总贡献率均大于98%，干扰较小，说明该方法有效，且能很好地反映样品的整体信息[24−25]。在三种肉汤中，对照组、双孢菇协助减盐前后组分分别处于第三、第四及第一象限，可将减盐前后各组分区分出来。从PC1 看，除鸡汤外，双孢菇协助减盐前后总体滋味差异较小，小于减盐前与对照组的差异。这一结果表明，双孢菇协助减盐前后之间的总体滋味差异小于对照组与减盐前之间的滋味差异。

2.3 游离氨基酸分析

由表1 可知，三种肉汤中都检测到17 种游离氨基酸，其必需氨基酸的种类均为7 种。双孢菇提取物减盐后17 种游离氨基酸中丙氨酸和谷氨酸在鸡汤中含量较高，分别为1.674、0.713 mg/mL；丙氨酸在骨汤中含量为1.403 mg/mL；甘氨酸和赖氨酸在鱼汤中含量较高，分别为2.249、0.693 mg/mL。添加双孢菇提取物后三种肉汤中的游离氨基酸含量显著高于未添加双孢菇提取物的含量（P<0.05）。其中丙氨酸、脯氨酸增加最明显，在鱼汤中均增加了0.417 mg/mL。根据参考文献[20,26]对游离氨基酸的滋味特性进行描述，游离氨基酸呈味特征以鲜味、甜味、苦味为主。呈味氨基酸的含量对汤的口感起着至关重要的作用。

表1 双孢菇提取物减盐前后在三种肉汤中游离氨基酸的种类及含量Table 1 Types and contents of free amino acids in three kinds of soup before and after salt reduction of Agaricus bisporus extract

如表1 所示，对比双孢菇提取物添加后呈鲜味、甜味、苦味的游离氨基酸含量显著增强（P<0.05）。由表2 可知，双孢菇提取物减盐后在三种肉汤中各游离氨基酸的滋味活性值均有所上升，但减盐后三种肉汤中的游离氨基酸对呈味贡献较小。从TAV 分析，TAV 数值越大呈味作用越显著，TAV>1 的组分对整体滋味有贡献。双孢菇提取物减盐后的TAV值均大于减盐前。谷氨酸鲜味很强，对汤风味具有重要贡献，具有形成肉鲜味和缓冲咸与酸等味道的特殊功效[27]。

表2 双孢菇提取物减盐前后在三种肉汤中游离氨基酸的TAV 值Table 2 TAV values of free amino acids in three kinds of soup before and after salt reduction of Agaricus bisporus extract

味觉之间具有协同增效作用，特别是鲜味能增强咸味，是在食盐含量较低的情况下保持或提高整体咸度的重要途径[28]。综上所述，双孢菇提取物协助减盐前后游离氨基酸含量对三种肉汤有呈味贡献。且双孢菇提取物中的Kokumi 肽可增强甜、咸和鲜味等感知，可以改变氨基酸和多肽等肉类衍生化合物的适口性[6]。

2.4 5′-核苷酸分析

在三种肉汤中测定双孢菇提取物减盐前后5′-核苷酸的含量。如表3 可知，CMP 和AMP 在双孢菇协助减盐后的含量显著高于减盐前（P<0.05）；UMP和GMP 在双孢菇减盐前后的含量变化不明显，都在同一显著性水平上（P>0.05）；IMP 在鸡汤和骨汤中含量变化不明显。三种肉汤中，鱼汤中IMP 的含量显著高于其他两种汤（P<0.05），其含量大约是鸡汤的4 倍，骨汤的19 倍；GMP 是本研究中含量最低的核苷酸，在鸡汤中的含量仅为0.008 mg/mL。5′-核苷酸IMP、GMP 和AMP 通常被认为是生肉中的味觉增强剂，GMP 和IMP 有助于强化鲜味、AMP 起到增强甜味的作用[27]。GMP 和IMP 不仅具有鲜味，而且与谷氨酸钠有协同作用。据报道，类味精氨基酸与GMP、IMP 和AMP 的协同作用可以大大提高鲜味口感[30]。

表3 双孢菇提取物减盐前后在三种肉汤中核苷酸的含量Table 3 Nucleotide content in three kinds of soup before and after salt reduction of Agaricus bisporus extract

如表4 所示，IMP 是鸡汤和鱼汤中TAV>1 的唯一核苷酸，添加双孢菇提取物对鸡汤和骨汤中IMP的含量影响不大；AMP、GMP 通过双孢菇协助减盐其在三种肉汤中的TAV 值均有所上升，但都还是小于1。由于谷氨酸和核苷酸之间的协同作用，它们对肉汤鲜味的贡献不容忽视[31]。综上所述，双孢菇提取物协助减盐后5′-核苷酸含量对鸡汤和骨汤有呈味贡献但影响不大，在一定程度上使鱼汤更加鲜美。

表4 双孢菇提取物减盐前后在三种肉汤中核苷酸的TAV 值Table 4 TAV values of nucleotides in three kinds of soup before and after salt reduction of Agaricus bisporus extract

2.5 目标肽的感官评价

将0.1%的目标肽EYPPLGR、EWVPVTK 分别添加到空白鸡汤中，两种肽在鸡汤体系中均表现出浓厚感、满口感、绵延感和增强味觉复杂口感的风味特征。如图4 所示，两种肽在鸡汤中增强咸味、鲜味及厚味效果明显，甜味感知也有所增强。除此之外，两种目标肽在鸡汤中都表现出酸味增强的特点，这可能是由于在合成肽的过程中醋酸盐的残留所造成的，或是目标肽本身具有酸味的特点。通过感官验证，双孢菇提取物中分离纯化鉴定出的两条Kokumi 目标肽在鸡汤中起到了减盐作用。

图4 两种目标肽在鸡汤中的滋味雷达图Fig.4 Taste radar map of two target peptides in chicken soup

3 结论

本研究发现双孢菇提取物对三种肉汤均起到减盐作用。试验结果表明，双孢菇提取物的添加使得肉汤中游离氨基酸的含量均有所增加，减盐后游离氨基酸含量显著高于减盐前；5′-核苷酸对鸡汤和骨汤的呈味贡献影响较小；感官评价确定双孢菇提取物的添加对肉汤起到增咸作用，并且会延长咸味在口腔中的持续时间，总体风味强度也有所增强。双孢菇提取物添加到肉汤里不是仅增加呈味核苷酸和氨基酸的含量，其中双孢菇提取物中含有的Kokumi 肽也起到增鲜增咸的效果。试验验证了双孢菇提取物在三种肉汤中协助减盐作用明显，在鱼汤中应用效果最佳，直接减盐33%。双孢菇提取物不仅起到减盐提鲜的效果还能增加汤的持久性、丰富性。