精液样本保存方式对精子DNA碎片率检测影响的实验研究

黄 诚，陆碧玉，代元平，黄李霜，杨金铃，黄丽华，陈大宇，蔡 稔，严提珍（柳州市妇幼保健院医学遗传科/柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室，柳州市生殖医学重点实验室，广西柳州 545001）

精子DNA 是男性将遗传物质传递给子代的载体，许多研究表明精子DNA 损伤会影响自然受精、胚胎发育以及辅助生殖的妊娠结局，并与男性不孕不育和复发性流产密切相关。当前业界广泛认为精子DNA 碎片率（DNA fragmentation index，DFI）可以较好反映整体精子DNA 受损程度，现已列为衡量精子质量的一项独立指标[1-3]。相对于常规的活力和生化检测，DFI 更侧重于反映精子遗传物质的健康度。如今用于检测精子DNA 完整性的方法有很多，其中应用最普遍的是精子染色质结构分析法（sperm chromatin structure analysis，SCSA），并且该方法可以在流式细胞仪上运用。流式细胞术（flow cytomtry，FCM）是分析分类单个细胞组群最为高效准确的技术，用流式细胞仪检测精子DFI可以在短时间内检测大量精子，将不同荧光信号的精子进行分类即可算出DFI，结果更为客观准确[4]。但在整个实验流程中依然存在可能会影响检测结果的因素，当精液样本留存时间过长可能出现精子核物质降解、微生物滋生、精子形态改变甚至破裂等情况[5-6]。所以在实际工作中精子DFI 检测的样本时效不容忽视，本实验将研究样本新鲜度对精子DFI 检测结果的影响，探讨在实际工作中该如何保存样本。

1 材料与方法

1.1 研究对象 随机选择2020年12月期间柳州市妇幼保健院生殖中心男科门诊日常送检的精液样本。纳入标准：①通过精液常规结果排除无精少精症患者；②排除样本液化不全患者。最终选取38份样本（样本提供者年龄26～52 岁）。本研究经医院伦理委员会批准（文件号：科研-2018-004），患者知情同意。

1.2 仪器与试剂 本实验使用试剂为深圳华康生产的吖啶橙染色液，样本检测使用美国BD FACSVia流式细胞仪。

1.3 方法

1.3.1 实验分组：每个样本充分液化后混匀分成4等份，分为A，B，C，D 共4 组：A 组当即检测，然后放置室温保存，每2h 再测1 次，共测得A1，A2，A3 三组数据；B 组放置2～8℃冰箱保存，每24h 检测1 次，连测3 天,共获得B1，B2，B3三组数据；C 组放-20℃冰箱冷冻，每周解冻测1 次，测完放回冰箱复冻，连测4 周，共获得C1，C2，C3，C4 四组数据；D 组放置-20℃冰箱冷冻，30天后解冻检测1 次，获得D1 组数据。

1.3.2 检测方法：按SCSA 法对精子细胞进行染色，每个样本采用中等流速计数10 000 个精子。正常精子由于DNA 双链结构完整其荧光信号以530nm为主，而DNA 异常精子由于存在单链片段而携带640nm 荧光信号会偏离正常群体，最后统计异常精子占总精子的比例即为精子DFI。

1.4 统计学分析 采用 SPSS 23.0 统计软件分析，将新鲜样本当即检测组（A1 组）DFI 结果与其他组的检测结果分别进行配对t检验，验证样本在不同条件保存后的结果变化，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测组与不同保存方式组DFI 水平比较 结果见表1。将新鲜样本当即检测组(A1 组)作为对照组，与其他组DFI 检测结果进行两两比较，A1 组DFI 与A2 组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），与A3 组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。对比结果显示新鲜样本在室温保存下2h 内检测结果比较稳定，放置4h 后检测结果升高，A1 组与B1，B2，B3 组比较差异均有统计学意义（均P＜0.001）；对比结果显示2～8℃不能保持精子DNA 结构稳定。A1 组与C1，C2，C3，C4 和D1 组的组间比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），对比结果显示-20℃冰冻可使样本稳定长达一个月，且期间样本经过反复冻融检测结果也无明显波动。

3 讨论

精子是以极小的体积将遗传物质和有限能量高度整合的生殖细胞。精核表面白的鱼精蛋白（protamine，HP）可形成大量二硫键使精子染色体高度压缩，从而在一定程度上保护DNA 免受伤害，使精子对各种外界环境因素有较强的抵抗力[7-8]。精子离体后随着时间的推移，染色质结构会由于表面蛋白的降解发生松散，对于本实验的DNA 完整性检测会造成一定干扰[9]。此外流式细胞仪主要用于检测单细胞悬液，要求精子形态必须保持完好，若样本不新鲜精子细胞可能发生肿胀、破裂或者微生物滋生等也会影响仪器的信号收集[10-11]。

在实际工作中，实验室不一定能做到在收到精液样本就当即检测。现实情况往往是患者一次取精要做多种检测项目，精液常规项目需要优先检测，其他的生化、DFI，病原体等检测可能会留存一段时间后再集中检测。而有些机构甚至是外送检测。如果不对精液样本进行妥善保存会对检测结果有很大影响。通常保存细胞样本需要用到-80℃冰柜或者液氮，还要配合冻干保护剂，这对实验室场地设备和人员操作有较高要求[12]。细胞经过-20℃冰冻会形成冰晶对内部结构产生机械损伤，反复冻融后容易发生破裂[13]。然而精液由于其精浆蛋白胶体成分影响，直接放置-20℃冰冻再复融未见精子细胞有明显变化[14]。本研究中用流式细胞仪检测-20℃保存后的样本依然可以收集到精子细胞，且DFI 检测值与新鲜原液相差无异，说明精子胞体和DNA结构没有因为冻融而明显破坏。与一些类似研究情况相符[15]。所以如果只为保障精子DFI 检测准确度，用一般冰箱-20℃冷冻即可有效保存精液样本。同时也可考虑分装个别样本长期冰冻再分次检测来作为该项目的日常质控对照品。若条件允许，还可以进一步研究-80℃冰柜直接冷冻是否能更长时间保持样本稳定。

综上所述，为保障精子DFI 检测结果的可靠性，精液样本应在采集后2h 内完成检测，样本在室温或2～8℃放置时间过长会使检测结果偏高，若需较长时间保存建议及时将新鲜样本放-20℃冰冻保存，时长可达一个月。