氮肥对2个杨树品种碳氮代谢的影响

杜常健,张 敏,张 磊,胡建军

(林木遗传育种国家重点实验室,国家林业和草原局林木培育重点实验室,中国林业科学研究院林业研究所,北京 100091)

杨树是重要的造林、经济树种,在世界及中国分布范围极广。随着经济的迅速发展,木材的需求量将越来越大,必须大力发展人工林。在集约经营的人工用材林中,由于林木长期的养分吸收以及不恰当的管理措施,造成人工林地土壤氮素匮乏,难以满足林木正常生长的生理需求,因此土壤氮素有效性已成为限制林木生长的主要因素[1],选育高氮利用和耐低氮的林木品种是解决这一问题的有效途径。

氮素是植物生长发育必需的大量元素之一,是氨基酸、蛋白质、核苷酸、叶绿素和许多细胞成分等的重要组成成分[2]。氮素利用与生物量的积累之间的联系机制尚不清楚。碳、氮代谢是植物生长发育最为重要的2个基础代谢途径。碳代谢过程包括碳的固定、碳水化合物的合成与利用等过程,固定二氧化碳(CO2)以产生糖、有机酸和储存碳水化合物。氮代谢过程包括氮素的吸收、同化、转运和氨基酸的合成,最后用于植物的生长。植物已经进化出一种复杂的调节机制来协调碳氮代谢,氮代谢的进行需要碳代谢提供碳骨架和能量,而氮代谢通过光合和光呼吸途径显著影响碳的固定和同化[3]。碳代谢与氮代谢之间具有高度相关关系,并且林木体内的碳氮代谢是影响木材形成的主要原因。

由于氮代谢的每一个进程都受到自然环境和基因型差异等条件调控,不同的植物品种间氮代谢及生长性状具有丰富的遗传变异。但是在林木育种研究方面,目前还较少关注氮利用效率的不同品种差异,忽视了氮利用效率基因型的研究。而选择高氮利用效率的林木基因型,是实现提高木材产量的有效策略。‘丹红’杨属于美洲黑杨 (Populusdeltoides),具有生长快、氮利用能力较强、干形好等特性,目前世界上人工栽培的杨树品种有90%以上都源于黑杨派[4]。‘通辽1号’杨属于小叶杨 (Populussimonii),是中国乡土树种,具有耐寒、耐旱、耐弱碱性、根系发达和抗风力强等特性,为中国东北及西北地区重要的防护林[5],但是小叶杨生长缓慢,氮利用能力较差。选择生长特性差异显著的两个杨树品种可以帮助我们解析不同杨树品种氮利用差异的机制,从而协助解决未来杨树育种和推广种植中遇到的实际问题。

因此,本研究以‘丹红’杨(P.deltoides‘Danhong’)和‘通辽1号’杨(P.simonii‘Tongliao1’)为材料,在田间设置施氮肥和不施氮肥处理,比较分析了两个树种的生长表型、总碳、总氮和水解氨基酸含量之间的差异,同时利用高通量测序技术获得了发育木质部的转录组数据,考察了它们的氮响应差异基因表达情况,为今后选育高氮利用效率的杨树新品种提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验地点、材料和处理

试验地设在北京市海淀区中国林业科学研究院玉泉山苗圃。试验地土壤全氮含量1.275 g/kg,全磷含量0.797 g/kg,全钾含量16.0 g/kg。以‘丹红’杨(美洲黑杨)和‘通辽1号’杨(小叶杨)为材料,选择健康一致的枝条剪成10 cm插穗。在2020年4月1日扦插于10 cm×10 cm营养钵中,基质配比为5∶1的泥炭和蛭石,并用多菌灵进行消毒处理。培养1个月后(5月16日)选择生长一致的杨树幼苗移栽入大田。每个树种均设置施氮肥处理(高氮,HN)和不施氮肥处理(低氮,LN),每处理3 次生物学重复,每重复6株幼苗,株行距为 30 cm×50 cm。6月20日、7月10日、8月6日进行施氮肥处理,每株苗4 g尿素[CO(NH2)2,含氮量46.0%]。根据土壤干旱程度平均每个月浇水1次,并定期除草。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 生长指标9月份,利用数字游标卡尺在地面以上5 cm处测量幼苗地径,利用塔尺测量株高。样品风干后,利用电子天平称取根、茎、叶生物量和总生物量。每个树种每个氮处理条件3个生物学重复,每重复6株幼苗。

1.2.2 总碳和总氮含量在幼苗离地面1 m处取树皮和木质部样品,并风干保存。每个树种每个氮处理条件3个生物学重复。样品(4～5 mg)在920 ℃下于填充有氧化铜的氧化管中氧化物烧。燃烧后形成的气体在填有还原铜的管内还原为N2(650 ℃)。气体通过氦载气流经水阱(P2O5)。 N2、CO2经过吸附与解吸附柱分离,然后再进入同位素质谱仪(IRMS,德国)进行同位素分析[6]。

1.2.3 水解氨基酸含量在幼苗离地面1 m处取树皮和木质部样品,并风干保存。每个树种每个氮处理条件3个生物学重复。称取混合均匀的适量样品,在水解管中加入10～15 mL 6 mol/L盐酸溶液,将水解管放入冷冻剂中,冷冻3～5 min,充氮保护,拧紧瓶盖,将水解管放在(110±1) ℃的电热鼓风恒温箱中水解22 h后,取出,冷却至室温。打开水解管,将水解液过滤至50 mL容量瓶中,用少量水多次冲洗水解管,水洗液移入同一50 mL容量瓶内,最后用水定容至刻度线,摇匀。准确吸取1.0 mL滤液移入至15 mL试管内,40 ℃减压至干;用1.0 mL pH 2.2的柠檬酸钠缓冲溶液附溶,振荡混匀后过0.22 μm滤膜;利用氨基酸自动分析仪(LA8080,日立,日本)测定水解氨基酸含量[7]。

1.2.4 纤维素、半纤维素和木质素含量在幼苗离地面1 m处取木质部样品,并风干保存。每个树种每个氮处理条件3个生物学重复。水溶性和醇溶性物质的存在,严重影响木质纤维素类生物质原料化学成分测定的结果。以纯水和乙醇对样品进行重复性洗脱,去除样品中包含的无机盐、可溶性糖、含氮化合物、叶绿素、脂质和蜡质等。纯化后的标准样品经过两步酸解,其中的纤维素、半纤维素和果胶等结构性多糖被水解为单糖的形式并溶解于水解液中。酸解后溶液在高效液相色谱仪(Agilent1260,安捷伦,美国)上获得纤维二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及半乳糖醛酸的浓度值,以计算纤维素、半纤维素和果胶含量(标准: NB/T 34057-2017)。在紫外分光光度计(TU-1901,北京)上320 nm处获得吸光度值,并计算酸溶木质素含量,酸解后分离的固形物经马弗炉灼烧,以前后差值得出酸不溶木质素含量。

1.3 转录组数据测定和分析

在9月份,于幼苗离地面1 m处,剥开树皮刮取发育木质部鲜样品,液氮保存并测定转录组。每个树种每个氮处理条件3个生物学重复。使用RNA试剂盒(Qiagen, Germany)提取总RNA。在Illumina Novaseq平台上对文库准备进行了测序,并生成了150 bp的双端读段。原始数据经过过滤后,使用TopHat比对到毛果杨参考基因组上v3.1[8-10],然后计算所有基因的FPKM值[9-10], 通过DESeq2 R包进行高氮和低氮条件下的差异表达分析。基于FPKM值的Baggerly检验确定不同分组配对比较的差异表达基因,判定标准为|log2FC| >0和矫正的P< 0.05。通过R包clusterprofile对候选基因和差异表达基因进行KEGG富集分析[11]。

1.4 数据处理

利用Excel和R(version 4.0.3)软件对原始数据进行统计分析、方差分析和作图。

2 结果与分析

2.1 施氮对2种杨树幼苗生长表型的影响

图1显示,在高氮条件下(HN),‘丹红’杨和‘通辽1号’幼苗的地径、株高、叶生物量、茎生物量、根生物量及总生物量均不同程度地高于低氮处理(LN),‘丹红’杨各指标的增幅均达到显著水平(P<0.05),而‘通辽1号’杨仅株高和叶生物量增幅显著;‘丹红’杨和‘通辽1号’杨的总生物量在高氮处理下分别比低氮处理提高了1.69倍和1.10倍。同时,在相同氮肥处理(高氮或者低氮)条件下,‘丹红’杨的地径、株高、根生物量、叶生物量、茎生物量、总生物量都显著高于相应的‘通辽1号’杨(P<0.05);如‘丹红’杨的总生物量在施氮条件下是‘通辽1号’杨的13倍,在不施氮条件下是‘通辽1号’杨的10倍。可见,增施氮肥处理促进了‘丹红’杨和‘通辽1号’杨的生长,且对‘丹红’杨的促进效果更明显;‘丹红’杨的在不同氮素环境下的木材产量都显著高于‘通辽1号’杨。

2.2 施氮对2种杨树幼苗碳、氮代谢的影响

在高氮条件下,‘丹红’杨和‘通辽1号’杨树皮和木质部的总氮含量均比低氮处理明显下降,且大多达到显著水平,同时2种杨树树皮和木质部的总碳含量与低氮处理相比大多没有显著变化。说明施氮处理能明显促进杨树树皮和木质部总氮含量,而对其总碳含量没有明显影响(图2)。另外,从图3可知,‘丹红’杨和‘通辽1号’杨树皮和木质部的纤维素、半纤维素和木质素含量在高氮和低氮肥处理间均没有显著差异;在相同氮肥处理条件下,‘丹红’杨与‘通辽1号’杨之间树皮和木质部的纤维素、半纤维素和木质素含量也没有显著差异。以上结果说明增施氮肥处理对杨树树皮和木质部的总氮含量有显著的抑制作用,对其总碳、纤维素、半纤维素和木质素含量均没有显著影响。

图2 ‘丹红’杨和‘通辽1号’杨在施氮肥和不施氮肥条件下木质部和树皮中总碳和总氮含量的差异Fig.2 Difference analysis of total carbon and total nitrogen in xylem and bark of ‘Danhong’ poplar and ‘Tongliao 1’ poplar under fertilization and no fertilization conditions

图3 ‘丹红’杨和‘通辽1号’杨在施氮肥和不施氮肥条件下木质部纤维素、半纤维素、木质素含量的差异Fig.3 Difference analysis of cellulose, hemicellulose, and lignin contents of ‘Danhong’ and ‘Tongliao 1’ under fertilization and no fertilization conditions

2.3 施氮对2种杨树木质部和树皮中水解氨基酸含量的影响

因为施氮处理对2种杨树木质部和树皮中总氮含量有显著的影响,所以进一步测定了木质部和树皮中的水解氨基酸含量。

结果(图4)显示,‘丹红’杨幼苗木质部中的天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(his)和精氨酸(Arg)含量在高氮和低氮的条件下都显著低于相应‘通辽1号’杨(图4,A),而‘丹红’杨幼苗树皮中的天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(pro)含量在高氮和低氮肥条件下都显著低于相应的‘通辽1号’杨(图4,B)。

同时,‘丹红’杨和‘通辽1号’杨树皮和木质部中的水解氨基酸含量在施氮肥后都有比不施肥处理显著降低的趋势。

2.4 施氮条件下2种杨树木质部氮响应差异表达基因分析

为了了解2个树种氮响应的差异表达基因,首先测定了‘丹红’杨和‘通辽1号’杨在高氮和低氮肥条件下发育木质部的转录组。统计(表1)结果显示,总共产生了5.4亿个高质量的测序片段, 总计产生81.7 Gb原始数据;以毛果杨参考基因组进行了比对,比对率80%以上;GC含量分布范围为43.14%～44.3%。进一步对测序数据进行了质控,Q20大于98%以上,Q30大于94%以上,说明测序数据质量合格。

表1 测序数据统计分析Table 1 Statistical analysis of sequencing data

其次,通过基因的差异表达分析发现(图5),‘丹红’杨在施氮处理后上调的基因有2 912个,下调的基因有3 491个,没有明显变化的基因有26 115个;‘通辽1号’杨在施氮肥处理后上调的基因有3 294个,下调的基因有2 947个,没有显著变化的基因有27 275个。

图5 ‘丹红’杨(A)和‘通辽1号’杨(B)在施氮肥和不施氮肥条件下的差异表达基因分析Fig.5 Differentially expressed gene analysis of ‘Danhong’ poplar (A) and ‘Tongliao 1’ poplar (B) under fertilization and no fertilization conditions

另外,利用KEGG数据库对‘丹红’杨和‘通辽1号’杨在施氮处理后上调和下调的差异表达基因进行了功能富集分析。结果(图6)显示,‘丹红’杨施氮后上调的差异表达基因显著富集到核糖体、氧化磷酸化、蛋白酶体、吞噬体、碳代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、糖酵解/糖异生、光合生物中的碳固定、果糖和甘露糖代谢、氨基酸的生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢、囊泡运输中的SNARE相互作用、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、磷酸戊糖等代谢途径途径;‘丹红’杨施氮后下调的差异表达基因主要富集到类黄酮生物合成、内质网中的蛋白质加工、苯丙素生物合成、植物-病原菌互作、植物激素信号转导、MAPK信号通路、氮代谢、玉米素生物合成等代谢途径。

padj表示校正后的P值;Down表示施氮处理后下调的基因,Up表示施氮处理后上调的基因。图6 施氮处理后2种杨树上调和下调差异表达基因的KEGG分析padj represents the corrected P value. Down represents the down-regulated gene after fertilization treatment, and Up represents the up-regulated gene after nitrogen fertilizer treatment.Fig.6 KEGG analysis of up-regulated and down-regulated genes of two poplar varieties after nitrogen fertilizer treatment

同时,‘通辽1号’杨施氮后上调的差异表达基因主要富集到植物激素信号转导、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、淀粉和蔗糖代谢等代谢途径,其下调的差异表达基因主要富集到核糖体、内质网中的蛋白质加工、柠檬酸循环(TCA循环)、光合作用、光合作用-天线蛋白、RNA转运等代谢途径。以上结果说明‘丹红’杨和‘通辽1号’杨的氮响应基因在碳代谢(如碳的固定和糖酵解/糖异生)和氮代谢(如氨基酸的合成)相关的富集通路有较大的差异。

3 讨 论

杨树具有速生、易繁殖、适应性强和生产力高等特性,在木材加工、碳汇造林、制浆造纸和生物燃料等方面发挥着重要作用[12-14]。世界上大部分杨树林生长在氮素贫瘠的地区[15],易导致杨树林生产力低下。因此本研究利用‘丹红’杨和‘通辽1号’杨两个材料进行了田间施氮试验,结果表明‘丹红’杨和‘通辽1号’杨的总生物量在氮肥处理后分别比不施氮处理提高了1.69倍和1.10倍,证明施加氮肥可以提高杨树的生物量,因此在大面积种植的人工林中可以适当施加氮肥从而提高木材的产量。同时,‘丹红’杨的总生物量在施氮条件下是‘通辽1号’杨的13倍,在不施氮肥条件下是‘通辽1号’杨的10倍。试验结果说明在不同的氮素环境下,‘丹红’杨的木材产量都远远高于‘通辽1号’杨,‘丹红’杨更加适合人工林的大面积推广和种植。‘丹红’杨的优异表现也为进一步选育优良杨树品种提供了坚实的种质基础。目前杨树氮素高效种质资源的收集、筛选和鉴定的遗传改良工作做得相对较少,因此本研究从可持续利用的角度出发,挖掘杨树氮素高效利用的种质资源具有重要经济价值。

基因差异表达最终需要代谢物含量变化来体现,因此本研究中测定了林木总碳、总氮、纤维素、半纤维素和木质素以及15种水解氨基酸的含量。木本植物为生物燃料和生物制品提供了大量的木质纤维素资源。总碳、纤维素、半纤维素和木质素是细胞壁的重要组成成分,也是木材的主要组成成分[22]。本研究中‘丹红’杨和‘通辽1号’杨之间的总碳、木质素、纤维素和半纤维素含量没有显著的差异,说明2个树种的木材材性没有差异,木材的用途也是一致的。施氮肥对2个杨树品种茎的总碳、木质素、纤维素和半纤维素含量没有显著的影响,说明氮肥的添加没有影响木材的材性。因此在杨树人工林种植中可以适量施加氮肥,不会影响木材的材性。氨基酸是植物体内氮素的主要存在方式之一。‘丹红’杨和‘通辽1号’杨两者之间的木质部和树皮中15种水解氨基酸含量差异显著,说明了2个树种之间的氨基酸代谢有较大的差异。施用氮肥处理后‘丹红’杨和‘通辽1号’杨的木质部和树皮中的多种水解氨基酸含量显著降低,说明了氮肥添加显著影响了氨基酸的积累量。虽然氨基酸含量仅占杨树总干重的小部分,却在杨树生长和生理过程中发挥着重要的作用。植物的生长和氮代谢都受氮素供应水平的调节,许多代谢途径受到氨基酸浓度的调节[23],这与本研究中氨基酸在氮代谢中发挥重要作用的结果一致。

4 结 论

本研究选用‘丹红’杨和‘通辽1号’杨幼苗在田间进行了施氮肥试验。研究发现,在不同的氮素环境下,‘丹红’杨的木材产量都远远高于‘通辽1号’杨,因此‘丹红’杨更加适合人工林的大面积的推广和种植。增施氮肥处理显著提高了‘丹红’杨木材的产量,在其人工林种植时可以适当施加氮肥。氮肥处理显著影响了杨树发育木质部碳固定、糖代谢、氨基酸合成等碳氮代谢相关途径的基因高表达,促进了杨树生物量的积累。氮肥的处理也影响了杨树茎的总氮和多种水解氨基酸的含量,但是没有影响其总碳、纤维素、半纤维素和木质素含量。试验结果为杨树氮利用效率的遗传育种研究工作提供了借鉴。