施加外源抗坏血酸促进马铃薯试管薯形成及其机制初步研究

雷春霞,叶明旺,李灿辉,龚 明*

(1 云南师范大学 生命科学学院,云南省马铃薯生物学重点实验室,生物能源持续开发利用教育部工程研究中心,云南省生物质能与环境生物技术重点实验室,昆明 650500;2 云南师范大学 马铃薯科学研究院,云南省马铃薯生物学重点实验室,昆明 650500)

马铃薯富含淀粉、蛋白质和多种重要营养物质,是世界上最重要的粮食作物之一[1-3]。马铃薯的块茎形成是一个复杂的发育过程,涉及到多重环境因素与植物激素及信号分子的互作以及这种互作对大量关键基因及多条信号转导与代谢途径的调控。这一过程包括一系列生理生化变化,如内源激素组成、含量及其比例的明显变化、叶片光合速率的提高、同化物输出的加快、蔗糖和淀粉含量的增加以及匍匐茎顶端特异蛋白的出现等。深入了解马铃薯块茎形成的分子机理可为今后通过精准分子育种手段来培育高产优质的马铃薯品种提供借鉴和新思路[4-6]。

马铃薯的块茎形成由4个连续阶段组成:(1)匍匐茎的形成和生长;(2)随后顶端区域弯曲成钩状;(3)亚顶端区域膨大;(4)块茎生长[6-7]。在影响马铃薯结薯的因素中,光周期和温度是最重要的环境因素,短日照(short days,SDs)和低温诱导结薯[8-9]。此外,马铃薯块茎的形成主要受其遗传特性的控制。在相同的外部环境中,不同品种的马铃薯形成块茎的能力不同[5]。马铃薯植株的发育阶段也是决定块茎形成的重要因素,它们必须达到一定的生理年龄才能响应诱导块茎形成的环境信号[6,10]。块茎的形成需要生化途径和形态发生的精确同步,这是由特定的基因表达和各种信号分子、特异蛋白、mRNA、miRNAs、植物激素和糖的产生所调控的[6,10]。参与马铃薯块茎形成过程的关键基因包括Solanumtuberosumself-prunning6A(StSP6A)、Solanumtuberosumself-prunning5G(StSP5G)、SolanumtuberosumCONSTANS(StCO)等[6]。

抗坏血酸(ascorbic acid,AsA),又称维生素C(vitamin C,VC),是植物细胞中最丰富的一种多功能非酶抗氧化剂,具有清除多种活性氧(reactive oxygen species,ROS)的巨大潜力,能够在非逆境和逆境条件下调节植物的一些基本功能,如蛋白质合成、细胞生长和分裂、防御化合物的产生、衰老、活性氧解毒等[11-13]。抗坏血酸在线粒体中合成,然后被运输到植物的其他部位[14-15]。植物细胞中AsA含量随生长条件和发育阶段而变化,其含量的变化可作为一种胞内信号通过调节激素信号通路基因和防御基因的表达影响植物的生长发育和抗逆性[15]。AsA不仅是控制细胞氧化还原平衡的关键成分,还是参与植物生长发育的关键调控因子[16],但其是否参与马铃薯的块茎形成,目前尚未见报道。

本文通过外源添加AsA处理研究了其对马铃薯块茎形成的效应及对10个结薯相关基因表达的影响,并研究了敲除结薯关键基因StSP6A对AsA诱导马铃薯结薯的影响,旨在揭示AsA是否以及如何参与马铃薯块茎的诱导和形成及可能的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材 料

试验材料为来自国际马铃薯中心(International Potato Center,CIP)的2个二倍体马铃薯种质材料CIP-149(Solanumphureja)和CIP-178(S.ajanhuiri)及1份四倍体主栽品种合作88(C-88,S.tuberosum),均由云南师范大学马铃薯科学研究院保存和提供。

材料预培养:所用试验材料为离体培养条件下的马铃薯无菌苗,剪取供试材料组培苗的单节茎段转接到培养瓶(MS+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂,pH=5.8)中,每个培养瓶接入10个单节茎段,置于(25±2) ℃、600 μmol/(m2·s)光照强度及16 h/8 h光周期条件下培养,1月龄的组培苗可用于下一步试验研究。

1.2 外源AsA处理对马铃薯试管薯形成的影响

为研究AsA对马铃薯块茎形成的影响,利用外源添加AsA处理二倍体材料CIP-178和CIP-149及四倍体品种C-88。将预培养材料的单节茎段转接到含30 g/L蔗糖并分别添加了终浓度为0(对照,CK),1、5、10、20、50 mmol/L AsA的1/2 MS固体培养基上,置于诱导块茎形成的全黑暗(18±2) ℃条件下培养,14 d后统计结薯个数并计算结薯率, 结薯率的计算方法为平均每100个茎段中结薯的个数,每个处理有3个重复。

1.3 不同pH值处理对CIP-149试管薯形成的影响

将含不同浓度(0、1、5、10和20 mmol/L)AsA的1/2 MS固体培养基离心并收集上清, 测定各个上清溶液的pH值。在1/2 MS培养基中加入1 mol/L的HCl,将培养基pH值调为上述添加了不同浓度AsA的对应pH值。

将预培养材料CIP-149的单节茎段转接到上述不同pH值、含3%(W/V)蔗糖的1/2 MS固体培养基中,在(18±2) ℃条件下的全黑暗培养间培养14 d后统计结薯个数并计算结薯率。

1.4 AsA处理条件下马铃薯块茎形成关键基因的RT-qPCR分析

以预培养1月龄的CIP-149为材料,将剪去叶片的单节茎段转接到分别添加了0(对照)或1 mmol/L AsA的1/2 MS培养基(含30 g/L蔗糖)中,在全黑暗及(18±2) ℃条件下培养。在5个时间点(0、3、9、12和16 d)剪取代表了马铃薯块茎形成5个典型阶段的样品用于总RNA提取,分别是腋芽(0 d)、长大的腋芽或刚长出的匍匐茎(3 d)、约1 cm长的匍匐茎顶端(9 d)、约1 cm长的带有匍匐茎的刚刚膨大的块茎(12 d)及约1 cm长的带有匍匐茎的生长块茎(16 d,图1)。

组培苗. CIP-149组培苗;0 d. 腋芽;3 d. 稍大的腋芽;9 d. 长约1 cm的匍匐茎顶端;12 d. 膨大的匍匐茎顶端;16 d. 生长中的块茎。图1 分别在5个时间点对马铃薯块茎形成不同阶段的匍匐茎/块茎顶端取样用于RNA提取Microplant. Tissue culture seedling of CIP-149; 0 d. Axillary bud; 3 d. Slightly larger axillary bud; 9 d. About 1 cm long stolon tip; 12 d. Swelling stolon tip; 16 d. The growing tuber.Fig.1 Tips of stolons/tubers at different stages of potato tuber formation were harvested for RNA extraction at five time points

使用Tiangen RNAprep Pure Plant Plus Kit试剂盒(Tiangen,北京)提取总RNA,使用PrimeScriptTMRT试剂盒(TaKaRa,北京),将800 ng总RNA逆转录为cDNA第一链。基于本实验室研究及相关文献[5-6,17-18]挑选出10个马铃薯关键结薯相关基因[StSP6A、StSP5G、StCO、Solanumtuberosumcyclingdoffactor(StCDF)、SolanumtuberosumphytochromeB(StPHYB)、Solanumtuberosumsucrosetransporter4(StSUT4)、Solanumtuberosumcalcium-dependentproteinkinase1(StCDPK1)、SolanumtuberosumGA20-oxidase(StGA20ox)、SolanumtuberosumBEL5(StBEL5)和Potatohomeobox(POTH)]进行表达量测定(表1)。

表1 用于RT-qPCR分析的马铃薯块茎形成相关基因信息Table 1 Information of genes related to potato tuber formation for RT-qPCR analysis

采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(TaKaRa,北京)在Roche Light Cycler 960(Roche Diagnostics, Basel,Switzerland)上进行RT-qPCR。反应体系为:10 μL(1 μL模板cDNA,上下游引物各0.4 μL,5 μL SYBR Green PCR Master Mix和3.2 μL ddH2O)。

采用内参基因L2[19],对目标基因的表达量进行校正。引物由Primer3 web(https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计(表2)。RT-qPCR反应程序为:95 ℃预孵育600 s,95 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,2步扩增45个循环,最后一步进行60～97 ℃熔解曲线分析。在RT-qPCR分析中,有3个独立的生物样重复和3个技术重复。采用比较CT法(2-ΔΔCT法)对RT-qPCR数据进行量化[20]。

1.5 StSP6A纯合突变体敲除载体的构建

质粒构建: 表达SpCas9的双元载体pKESE401及中间载体pCBC-DT1T2见前文[28]。从Spud DB数据库(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu)下载获得马铃薯StSP6A基因序列(基因ID:Soltu.DM.05G026370.1)。利用靶位点在线设计工具CRISPR-P 2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计StSP6A的靶位点,筛选出其中2条20 nt的sgRNA(sigle guide RNA)序列,构建的敲除载体引物分别为DT1F,TCGAAGTAGTGATTGGGTTGCATAACAA-CTTGTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC和DT2R,TTCTAGCTCTAAAACTTCACTAGGTCTGTTGAT-CTCAATCTCTTAGTCGACTCTAC。

DT1F和DT2R用于扩增pCBC-DT1T2。将扩增产物纯化后, 通过无缝克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit,Vazyme)连接到被BsaI酶切的pKESE401中[29]。构建的CRISPR/Cas9载体如图2,A所示。

A. StSP6A的基因结构以及靶位点原理图,其中2个gRNAs序列用黑线划线,PAM用红线划线;B. 转基因株系的突变模式。所有转基因株系后面都有对突变类型的描述:i=插入,d=删除。i和d对应的数字表示碱基对变化的数量。插入用绿色字母表示(G,A,C,T),删除用绿色“”表示。图2 StSP6A靶位点(A)及其突变模式(B)示意图A. The schematic diagram of StSP6A with target sites. Two gRNAs sequences were underlined by black lines, and PAMs were marked by red lines. B. The StSP6A mutation patterns in transgenic lines. All transgenic lines are followed by a description for the mutation type: i = insertion and d = deletion. The number associated with i and d indicates the number of base pair changes. Insertion was shown in green letter(G, A, C, T), and deletion are indicated by a green “”.Fig.2 The schematic diagram of StSP6A target sites(A) and the mutation patterns(B) in transgenic lines

马铃薯的农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)转化:本研究使用的材料为二倍体马铃薯CIP-149,农杆菌转化按照之前的方法[28,30],并进行如下修改:预培养2 d后,将外植体与携带有双靶载体pKSE401的农杆菌在含有2 mg/L NAA(α-napthaleneacetic acid, α-萘乙酸)和1 mg/L ZT(zeatin trans isomer,玉米素,Phytotechlab)的LB培养基上共培养2 d,然后更换到含0.1 mg/L NAA+2 mg/L ZT的愈伤组织诱导培养基上诱导2周,最后更换到0.01 mg/L NAA和1 mg/L ZT诱导再生培养基上进行诱导,每2周更换1次培养基,直至出芽。将再生苗切下,扦插至含50 mg/L卡那霉素(kanamycin sulfate)和200 mg/L特美汀(timentin,Phytotechlab)的筛选培养基上进行筛选。经过2轮筛选后,提取正常生根的再生苗的DNA,用横跨靶位点的特异性引物进行扩增。特异性引物为5′-AGGCGGCATGTCTTCTAGAG-3′和5′-TAAACCCCTCTACCCCTCCA-3′。将PCR产物纯化后克隆到pBM16A载体(Biomed,北京)中, 转化感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)。从每个转化子的DNA中选择10个菌落在生工生物技术公司(上海)进行测序。采用Geneous 4.8.3软件进行序列分析。

通过上述转化过程,共获得125株转基因植株。对每个转基因植株的靶位点进行测序,每株10个无性系,共得到3个StSP6A纯合突变体(sp6a85、sp6a107和sp6a113)。突变类型如图2,B所示。

1.6 外源AsA处理对StSP6A纯合变体sp6a85、sp6a107和sp6a113试管薯形成的影响

为研究外源添加AsA对StSP6A纯合突变体马铃薯块茎形成的影响,利用获得的CIP-149的StSP6A敲除突变体,将CIP-149野生型对照和StSP6A纯合突变体(Sp6a85、sp6a107和sp6a113)的单节茎段转接到含30 g/L蔗糖并添加了0、1、5、10和20 mmol/L AsA的1/2 MS固体培养基上,在(18±2) ℃全黑暗培养条件下培养14 d后统计结薯率。

1.7 数据统计分析

利用SPSS 22.01进行统计分析。数据采用单因素方差分析(ANOVA),并以至少3次重复的平均值±标准差表示。在*P<0.05和**P<0.01水平评估差异显著性。

2 结果与分析

2.1 外源AsA处理对马铃薯试管薯形成的影响

以2个二倍体马铃薯CIP-149、CIP-178和1个四倍体品种C-88为材料,研究在含30 g/L蔗糖的1/2 MS培养基中加入AsA对其块茎形成的影响。结果表明,在培养基中加入终浓度为1、5、10、20和50 mmol/L的AsA时,CIP-149的结薯率呈现先增加后降低的趋势(图3,A)。与0 mmol/L AsA的对照相比,CIP-149在0～5 mmol/L AsA浓度下的结薯率随浓度增加结薯率显著提高(图3,A)。其中,1和5 mmol/L AsA处理下的结薯率分别是对照的3.6倍和5.84倍,此后随AsA浓度增高,结薯率逐渐下降。对其生长表型的观察表明,随加入的AsA浓度逐渐升高,匍匐茎逐渐变短,50 mmol/L AsA条件下,结薯率为0,茎段几乎全部枯死(图3,B)。

*和**分别表示P<0.05和P<0.01水平差异显著。下同。图3 外源抗坏血酸处理对马铃薯CIP-149结薯率和生长表型的影响* and ** indicate significant difference at P <0.05 and P <0.01 levels, respectively. The same as below.Fig.3 Effects of exogenous ascorbic acid treatments on tuberization percentage and growth phenotype of CIP-149 potato plantlets

AsA对CIP-178和C-88结薯的影响与CIP-149类似。结果显示,在培养基中加入终浓度为1、5、10和20 mmol/L的AsA时,CIP-178和C-88的结薯率均呈现先增加后降低的趋势(图4)。与0 mmol/L AsA的对照相比,CIP-178在1 mmol/L和5 mmol/L AsA浓度下的结薯率均显著增加,分别是对照的4.47倍和3倍(图4,A);C-88在1和5 mmol/L AsA浓度下的结薯率均显著增加,分别是对照的4倍和16.67倍(图4,B)。20 mmol/L AsA条件下,CIP-178和C-88的结薯率均为0。

图4 外源抗坏血酸处理对马铃薯结薯率的影响Fig.4 Effects of exogenous ascorbic acid treatments on tuberization frequency of potato plantlets

上述结果表明,外源添加AsA能够显著诱导马铃薯块茎形成,1 mmol/L和5 mmol/L AsA处理均可显著提高3个马铃薯材料的结薯率,其中,CIP-149和C-88的适宜诱导浓度为5 mmol/L,CIP-178的适宜诱导浓度为1 mmol/L。

2.2 不同pH值处理对马铃薯试管薯形成的影响

AsA是一种天然的有机酸,加入培养基以后,会导致培养基pH值下降。将添加了不同体积摩尔浓度AsA的1/2 MS固体培养基离心,测定其上清的pH值,结果显示,随AsA浓度增加,培养基pH值逐渐降低(表3)。

表3 含不同浓度AsA的培养基pH值Table 3 pH values of media containing different concentrations of AsA

为阐明AsA诱导马铃薯块茎形成过程中pH的效应,在含3%(W/V)蔗糖的1/2 MS培养基中加入1 mol/L的HCl,将培养基分别调为表3所示的几个pH值。剪取预培养CIP-149的单节茎段转接至不同pH值的培养基中,检测改变培养基pH对马铃薯结薯的影响。结果显示,随pH下降,CIP-149的结薯率呈现先增加后降低的趋势,在pH 4.23(对应5 mmol/L AsA)时的结薯率最高(24%),为对照的2.18倍(图5,A)。而外源添加5 mmol/L AsA的结薯率(81.11%)为对照的5.84倍(图3,A)。表明在外源添加AsA处理诱导结薯的过程中,AsA导致的培养基pH下降也可以诱导结薯率的增加,但AsA本身起更重要的作用。

图5 培养基不同pH值对CIP-149试管薯形成的影响Fig.5 Effects of different pH values in culture medium on microtuber formation of CIP-149

2.3 AsA诱导试管薯形成过程中关键结薯相关基因的表达分析

马铃薯的块茎形成需要环境、生化和遗传因素的共同作用,是生化途径激活/抑制和形态发生的精确同步,这两个过程都由特定的基因表达模式控制[5,31]。图3,A和图4的结果表明,AsA处理可以显著诱导马铃薯的块茎形成,表明AsA可能导致一些与块茎形成相关基因表达的变化。基于目前该领域的研究进展,研究选取了10个参与马铃薯块茎形成的关键基因(表1),通过RT-qPCR分析了它们在AsA诱导马铃薯块茎形成过程中的表达情况(图6)。由于1 mmol/L AsA处理可以显著提高马铃薯CIP-149的结薯率(图3,A),但对马铃薯组培植株生长影响不明显(图3,B),因此,研究以该浓度检测AsA处理对10个结薯相关基因表达的影响。

图6 外源抗坏血酸处理对马铃薯CIP-149试管薯诱导和形成过程中块茎形成相关基因表达的影响Fig.6 Effect of exogenous ascorbic acid on expression of tuberization-related genes during microtuber induction and formation in potato CIP-149

StSP6A是控制马铃薯块茎形成的关键基因,短日照激活其表达。在长日照条件下,StCO转录因子通过激活StSP5G,抑制StSP6A的表达。在短日照条件下,由于缺乏StSP5G,叶片中的StSP6A被激活,然后,StSP6A蛋白通过韧皮部从叶片运输到匍匐茎。

在匍匐茎顶端,StSP6A形成一种促进块茎形成的块茎形成激活复合体[9,17-18,21-22]。本试验中,在马铃薯块茎形成的不同阶段,StSP6A的表达量极显著增加,尤其是在块茎形成诱导条件下培养12 d和16 d,对照组(0 mmol/L AsA)在第12天和16天的表达量较0 d分别增加8 864.9倍和9 222.9倍,1 mmol/L AsA处理组在第12天和16天的表达量较0 d分别增加8 393.8倍和8 971.1倍(图1和图6,A)。AsA处理在块茎形成前期的第3天(略大的腋芽)和第9天(生长的匍匐茎)(图1和图6,A)可显著提高StSP6A的表达水平,其表达量分别是对照的13.6倍和5.4倍,表明AsA处理可在马铃薯块茎诱导和早期形成过程中快速提高StSP6A的表达水平。

StSP5G作为StSP6A转录的抑制因子负调控马铃薯的块茎形成[23]。结果表明,StSP5G在块茎形成前(第3天和第9天,图1)的表达量都低于0 d,第3天对照组和AsA处理组的表达量分别为0 d的48.86%和29.9%。第9天分别为0 d的29.88%和36.2%。但在块茎开始膨大和块茎生长阶段(第12天和第16天,图1),StSP5G的表达量有大幅度的上调,且AsA处理组的表达量均显著高于对照组(图6,B)。

StCO在长日照条件下抑制StSP6A基因的表达,负向调控马铃薯的块茎形成[21-22]。在试验的块茎诱导和形成过程中,对StCO表达分析的结果表明,在块茎诱导和形成的3～16 d(图1),StCO的表达水平在对照组和AsA处理组中总体上都低于0 d;且在9～16 d期间,AsA处理组的StCO表达量均显著低于对照组(图6,C)。

StCDPK在马铃薯块茎形成初期表达量急剧升高并受高浓度蔗糖诱导[24]。结果表明,在块茎诱导和形成的3～16 d(图1),StCDPK在对照组和AsA处理组的表达量整体上呈先急剧上升后下降的趋势;其中,第9天的表达量最高,对照组和AsA处理组第9天的表达量可达0 d的1 553.3倍和1 633.8倍(图6,D)。

GA20氧化酶(GA20ox1)是GAs合成途径中的关键调控酶,StGA20ox1的表达水平与块茎形成时间呈负相关,该基因转录的增强延缓了块茎的形成,而表达的抑制则加速了块茎形成[25,32]。结果表明,StGA20ox在块茎诱导形成的0～12 d表达量呈上升趋势,在第16天表达量略有下降;在3～16 d,AsA处理组StGA20ox表达量均显著低于对照组(图6,E)。

StBEL5-POTH1异源二聚体抑制GA20ox1启动子活性,降低GAs水平[26]。在本试验中,StBEL5在块茎诱导形成的3～16 d的表达量除第3天低于0 d外,AsA处理组和对照组的StBEL5表达量总体上呈持续增加的趋势, 但处理组和对照组之间差异不显著(图6,F)。POTH的表达量在0～16 d总体上变化幅度不大(图6,G)。

StCDF1作为生物钟组件抑制StCO的表达[22]。结果表明,在AsA处理组中,在块茎诱导形成的3～16 d,StCDF1的表达量均明显低于0 d;此外,除在第3天AsA处理组中的StCDF1表达量略高于对照组之外,在9～16 d AsA处理组中的StCDF1表达量均显著低于对照组(图6,H)。

StPHYB是一种能感知光周期的光受体,控制光周期依赖的块茎形成[5,8]。StSUT4通过调控基因如StSP6A、StCO等的表达以及抑制叶片蔗糖输出来抑制马铃薯的块茎形成[27]。在本试验中,StPHYB和StSUT4在块茎诱导形成的3～16 d,AsA处理组和对照组的表达量变化较小,总体上表现为表达量下降或不变(图6,I和图6,J)。这可能与本试验在全黑暗条件下的培养有关,具体表达变化调控机制尚待进一步研究。

2.4 AsA处理对StSP6A纯合突变体试管薯形成的影响

以上结果表明,在马铃薯块茎诱导形成过程中,StSP6A表达急剧上调(图6,A),AsA处理能显著提高马铃薯的结薯率(图3,A、图4,A和图4,B),也能显著提高StSP6A的表达量(图6,A)。为明确StSP6A在AsA诱导块茎形成中的作用,通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑敲除StSP6A基因,获得3个StSP6A纯合突变体sp6a85、sp6a107和sp6a113(图2)。

从图7可看出,虽然1～10 mmol/L外源AsA处理可显著促进野生型(WT)CIP-149的块茎形成,但在0、1、5、10和20 mmol/L AsA处理下,敲除StSP6A的纯合变体sp6a85、sp6a107和sp6a113的块茎形成都受到了强烈抑制,表明StSP6A参与了自然结薯和AsA诱导的结薯调控。

A. WT和StSP6A纯合突变体(sp6a85、sp6a107和sp6a113)在不同浓度AsA处理下的结薯率;B. 不同浓度AsA处理对WT及StSP6A纯合突变体sp6a85试管薯形成影响的表型观察。图7 外源AsA对马铃薯CIP-149野生型(WT)及敲除StSP6A的纯合突变体结薯率和生长表型(sp6a85)的影响A. Tuberization frequency of WT and the StSP6A null-mutants (sp6a85, sp6a107 and sp6a113) under different concentrations of AsA treatments; B. Phenotypical observation of effects of different concentration of AsA treatment on microtuber formation in WT and the StSP6A null-mutant sp6a85.Fig.7 Effects of exogenous AsA treatments on tuberization percentage and growth phenotype (sp6a85) of CIP-149 wild type(WT) and knockout of StSP6A null-mutants of the potato CIP-149

3 讨 论

AsA是植物细胞中最丰富的抗氧化剂, 除具有较高的抗氧化活性外,AsA也是细胞和细胞器氧化还原状态的中心调节剂,参与调节光合作用、生长发育、细胞壁生物合成、种子萌发、开花时间、果实软化和衰老、采后贮藏、信号转导和增强植物对不利环境的抗性等[11,33-36];另一方面,马铃薯块茎形成过程中匍匐茎顶端的块茎发育是由特定的基因表达模式控制的复杂过程[31]。然而,AsA是否参与马铃薯块茎诱导和形成的调控,目前尚不清楚。本研究结果表明,外源AsA处理3个马铃薯材料CIP-149、CIP-178和C-88均能使其结薯率显著提高,并且结薯率都呈现了一个先升高后降低的趋势,表明适宜浓度(1～5 mmol/L)的AsA处理能诱导和促进马铃薯块茎的快速形成。这个结果不仅丰富了对AsA生物学功能的认识,而且由于AsA的易得和廉价,也为提高工厂化生产的马铃薯脱毒微型种薯产量提供了一条可行的路径。

马铃薯的块茎形成过程涉及到多重环境因素与植物激素及信号分子的互作以及这种互作对大量关键基因及多条信号转导与代谢途径的调控;其中,StSP6A基因及其编码蛋白在马铃薯块茎的诱导和形成过程中起关键作用[6,21-23]。本研究表明,在马铃薯块茎诱导形成过程中,StSP6A的表达显著增强;此外,AsA处理可以显著提高StSP6A的表达水平,尤其是在块茎形成前期。通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑敲除StSP6A基因,可消除外源AsA诱导StSP6A纯合突变体sp6a85、sp6a107和sp6a113的结薯效应。这些结果都清楚表明,StSP6A的表达深度参与了AsA诱导的块茎形成过程。

StCO可通过转录激活StSP6A的负调控因子StSP5G负向调控StSP6A的表达[5]。本研究表明,在9～16 d,AsA处理组中StCO的表达量均显著低于对照组。StSP5G在块茎形成前(第3天和第9天)的表达量都低于0 d,暗示着StCO和StSP5G作为马铃薯块茎形成的负调控因子可能参与了AsA诱导的块茎形成。

StCDPK1在马铃薯块茎形成初始阶段的匍匐茎膨大部分高表达[24]。本结果也表明StCDPK在块茎形成之前的第9天,表达量达到了0 d的1 500倍以上,表明StCDPK在马铃薯块茎形成过程中发挥重要作用。

GAs是一种高效的植物生长调节剂,能够影响植物的发育进程[37]。GAs对马铃薯块茎形成具有抑制作用[6]。GA合成途径中的关键调控酶GA20ox1负向调控马铃薯的块茎形成,过表达StGA2ox1导致块茎形成提前,抑制其表达则块茎形成推迟[25]。本研究表明,在3～16 d,AsA处理组的表达量均显著低于对照组,暗示AsA可能通过调控StGA20ox的表达来调控马铃薯块茎形成。

Chen等发现StBEL5和POTH1协同互作抑制StGA20ox1的表达,进而降低块茎形成期间GAs的合成[26]。本研究表明,StBEL5在块茎诱导形成的9～16 d,表达量总体上呈持续增加的趋势。马铃薯POTH1基因受光诱导表达[6]。本研究结果显示,POTH在块茎诱导形成的0～16 d,AsA处理组和对照组中的表达量变化相对不大,这可能与试验材料是在离体条件下的全黑暗环境中培养有关。

自然条件下,马铃薯的块茎形成是一个受光周期调控的生理过程[5,18]。本研究试验材料是在离体条件下的全黑暗环境中培养(这也是离体条件下诱导马铃薯微型薯形成的标准条件),因此,有关受生物钟调控的基因如StCO、StCDF、StPHYB和StSUT4的表达与正常光周期条件下的结果并不完全一致,这种在全黑暗培养条件下结薯相关基因的表达模式与块茎形成的关系有待进一步深入研究。

AsA是一种存在于所有生物体内的基本化合物,在植物生长发育、激素信号以及应激防御网络等多个方面具有重要作用[38]。在植物的生长发育过程中,不同基因在不同时期的有序表达调控着植物的形态建成和生长期转变[39]。本结果表明,AsA处理使不同块茎形成相关基因的表达在块茎形成的不同阶段得到增强或抑制,说明AsA可能是在块茎形成相关基因的上游发挥作用,并通过调控这些基因的表达来诱导结薯。基于以上结果,笔者提出了一个可能的模型来说明AsA参与调控马铃薯块茎形成相关基因表达、进而调控马铃薯的块茎形成(图8)。

红色标记为马铃薯块茎诱导形成过程中表达上调的基因,蓝色标记为表达下调或表达基本不变的基因。图8 AsA通过激活/抑制块茎形成相关的信号转导通路诱导马铃薯块茎形成的可能模型Red marks indicate the genes with up-regulated expression, whereas blue marks represent the genes that are down-regulated or whose expression unchanged during induction and formation of potato tubers.Fig.8 A possible model for the AsA-induced tuber formation in potato by activating/inhibiting the tuberization-related signal transduction pathways

综上所述,外源AsA处理可诱导马铃薯块茎形成,AsA诱导的块茎形成可能与AsA调控的块茎形成信号通路及相关基因的表达有关,特别是StSP6A在AsA处理过程中的块茎形成早期表达量极显著上调。敲除StSP6A可消除外源AsA诱导的结薯作用。这些结果表明,AsA诱导马铃薯块茎形成是通过调控与块茎形成相关的基因表达和激活信号转导通路来实现的,而StSP6A在AsA诱导马铃薯块茎形成中起着关键作用。