基于UHPLC - Q - Orbitrap MS/ MS 的扶正抗癌Ⅱ方药效物质基础及其干预结肠癌作用机制的网络药理学研究*

周敏华，金 军△，王红刚，蔡大可，黄晓霞，刘喜娟，余靖华

（1.广东省中西医结合医院，广东 佛山 528200； 2.广东药科大学，广东 广州 510006； 3.广东省第二中医院·广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095； 4.广东省佛山市南海区人民医院，广东 佛山 528200）

结肠癌每年造成全球80 万人过早死亡［1］。中医认为，结肠癌属“癥瘕”范畴，是由于正气亏虚、瘀、毒等在体内郁结而成。已有研究发现，植物中的化学物质等会干扰结肠癌的发生与发展［2］。广东省佛山市南海区名中医金军教授以扶正培本结合消痞散结为治法，自拟扶正抗癌Ⅱ方（FZKAⅡ方）治疗结肠癌，由党参、五爪金龙、白术、茯苓、薏苡仁、法半夏、浙贝母、陈皮、青皮、制仙茅、杜衡、山海螺、菝葜等组方，能有效预防肿瘤的发生与发展，改善癌因性疲乏症状［3］。本研究中采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道肼高分辨串联质谱（UHPLC - Q - Orbitrap MS/ MS）法检测得到FZKAⅡ方水提液化学成分，并采用网络药理学对复方化学成分进行靶点预测及在线数据库收集疾病靶点，以探讨FZKAⅡ方干预结肠癌的作用机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 仪器与试药

仪器：UHPLC - Q - Orbitrap HRMS 型液质联用系统（美国Thermo Fiser Scientific 公司）；Cubis型电子天平（德国Sartorius 公司，精度为百万分之一）；98 - Ⅰ- C型数显控温电热套（湖北泰维科技实业股份有限公司）；KQ-300DE型超声仪（昆山市超声仪器有限公司，功率为300 W，频率为40 kHz）；N-1300 型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）。

试药：党参（批号为20211101），五爪金龙（批号为20211201），白术（批号为20220101），制仙茅（批号为20211201），法半夏（批号为202201228），茯苓（批号为20220101），杜衡（批号为20190601），山海螺（批号为20200701），菝葜（批号为20210601），浙贝母（批号为20220201），薏苡仁（批号为20220101），陈皮（批号为20211101），青皮（批号为C22103003），均购自佛山市中天中药饮片有限公司；松脂醇二葡萄糖苷对照品（批号为20011401），芦丁对照品（批号为21010803），齐墩果酸对照品（批号为21031204），绿原酸对照品（批号为21032502），辛弗林对照品（批号为0727 - 200004），均购自成都普菲德生物科技有限公司，含量大于98%；贝母素乙对照品（批号为10751-201110），党参炔苷对照品（批号为111732 - 201908），阿魏酸对照品（批号为110773 - 201915），茯 苓 酸 对 照 品（ 批 号 为wkq210517054），白术内酯Ⅰ对照品（批号为wkq21050705），均购自四川维克奇生物科技有限公司，含量大于98%；β- 谷甾醇对照品（批号为0851 - 9601），紫丁香苷对照品（批号为111574 - 200603），均购自中国食品药品检定研究院，含量大于98%；乙腈（批号为21101121G118），甲酸（批号为C12851411），甲醇（批号为C15443672），均为质谱纯，购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 色谱与质谱条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH Shlield RP18柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 µm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脱（1～30 min 时95%A →5%A，5%B →95%B）；流速：0.3 mL/ min；柱温：40 ℃；进样量：2µL。

1.2.2 质谱条件

离子源：可加热式电喷雾离子源（HESI）；检测方式：正负离子切换模式；喷雾电压：3 500 V（正离子模式），3 200 V（负离子模式）；辅助气加热温度：320 ℃；离子传输管温度：320 ℃；鞘气体积流速：35 arb；辅助气体积流速：15 arb；扫描模式：一级质谱［全扫描，质荷比（m/z）100～1 500，质量分辨率为70 000］，动态数据依赖性扫描（二级质谱）。

1.3 中药复方浸膏制备

取党参、五爪金龙、白术、制仙茅、法半夏、茯苓、杜衡、山海螺、菝葜、浙贝母、薏苡仁、陈皮、青皮等药材各适量，分别粉碎成粗粉，置圆底烧瓶中，加蒸馏水（浸过药面5 cm）浸泡30 min，煎煮2 次，第1 次煮沸后再用文火煎煮30 min，第2 次煮沸后再用文火煎煮25 min，合并药液，旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏，待用。

1.4 溶液制备

取中药复方浸膏1 g，置25 mL 容量瓶中，加适量80%乙醇使溶解，超声助溶，0.22µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得中药复方供试品溶液。分别取松脂醇二葡萄糖苷、芦丁、齐墩果酸、绿原酸、辛弗林、贝母素乙、茯苓酸、党参炔苷、苍术酮、白术内酯Ⅰ、β-谷甾醇、阿魏酸、紫丁香苷对照品各1 mg，精密称定，分别置5 mL容量瓶中，加50%甲醇使溶解，配制成质量浓度为0.2 mg/mL 的单一对照品贮备液；精密量取1 mL，加50%甲醇稀释成质量浓度为25µg/mL的混合对照品溶液。

1.5 网络药理学分析

成分靶点收集：将筛选出的化学成分的英文名称输入中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）进行检索，以口服生物利用度（OB）≥20%、类药性（DL）≥0.1 为筛选条件，其中TCMSP 数据库中未找到的化学成分，借助Swiss ADME 平台（http：//www.swissadme.ch/）进行筛选，以胃肠道吸收（GI absorption）的得分为“high”，DL至少通过2 个“Yes”进行筛选。筛选得到的活性成分逐个输 入Chemical Book 数 据 库（https：// www.chemical⁃book.com/ ProductIndex.aspx）或PubChem 数 据 库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），记录化合物的SMILES 号或下载化合物的结构，保存为.sdf 文件。在Swiss TargetPrediction 数据库（http：// www.swisstarget⁃prediction.ch/）中输入化合物的SMILES 号或打开.sdf文件，以“Homo sapiens”为限定条件预测成分的作用靶点，并使用PharmMapper 数据库（http：// www.lilab -ecust.cn/pharmmapper/）补充成分靶点。

疾病靶点收集：以“Colon Cancer”为关键词，分别在DisGeNET 数据库（https：// www.disgenet.org/）、Gene⁃Cards数据库（https：//www.genecards.org）、OMIM 数据库（https：// omim.org/）中收集结肠癌的疾病靶点，删除重复靶点，保留与结肠癌相关的靶点。

关键靶点筛选：将成分靶点和疾病靶点合并筛选，保留共有靶点，即为FZKAⅡ方干预结肠癌的关键靶点。

活性成分- 关键靶点- 通路网络构建：将关键靶点输入String 11.5 数据库（https：//cn.string-db.org），以“Homosapiens”为筛选条件，构建蛋白互作（PPI）网络，设定阈值“highestconfidence”> 0.9，其余条件均为默认。使用Cytoscape 3.9.1 软件构建活性成分- 关键靶点-通路网络。

GO富集分析和KEGG通路富集分析：使用Ensembl数据库（http：// grch37.ensembl.org/ index.html）将Gene name 转换为Ensembl ID，使用基迪奥生物信息云平台（Omicshare，https：//www.omicshare.com/）将关键靶点进行基因本体论GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，前者包括GO 生物过程分析（GO Biological Pro⁃cesses）、GO 分子功能分析（GO Molecular Functions）、GO 细胞组分分析（GO Cellular Components），分析条件均为默认参数，并对所得结果进行可视化。

1.6 分子对接

为进一步分析FZKAⅡ方成分与靶点结合的强度，使用AutoDock Vina v4.2.6 软件对FZKAⅡ方的成分和靶点分别进行分子对接，以受体和配体的结合能小于- 7 kcal/ mol 为结合作用较好，结合能数值越低，产生相互作用所需的能量就越低［4］。在PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.Gov）中下载化合物的结构，PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）中下载靶点的三维（3D）结构；使用Discovery Studio 4.5 Client 删除蛋白质靶点的水分子、配体、离子等，保存为.pdb文件；使用AutoDock Vina v4.2.6 软件对化合物和靶点进行对接，在蛋白质分子上设置中心，并设置X，Y，Z的参数（设置为126）以确保蛋白质被完全覆盖，为寻找配体分子的最低能量构象以模仿自然体系中的分子稳定构象，进行能量优化，优化次数设置为100［5］，并进行柔性对接；使用PyMOL 2.4.1 软件对对接结果进行可视化。

2 结果

2.1 FZKAⅡ方化学成分分析

UHPLC - Q - Orbitrap MS/MS 正负离子切换模式下检测，得到FZKAⅡ方水提液质谱总离子流图（图1）；通过自建的数据库、对照品的裂解规律、特征碎片离子、Compound Discover 3.2软件的分析、文献［6-20］对化学成分进行鉴定，共鉴定出128 个成分，其中黄酮类35 个，萜类17 个，苯丙素类17 个，木脂素类6 个，酚类9 个，生物碱14 个，有机酸11 个，氨基酸6 个，挥发油1 个，炔类3 个，甾体类1 个，其他8 个。结合网络药理学分析结果，与关键靶点关联性较强的29个成分见表1。

表1 FZKAⅡ方水提液中化学成分鉴别结果Tab.1 Identification results of chemical components in FZKA Ⅱwater extract

A.负离子模式 B.正离子模式图1 FZKAⅡ方水提液质谱总离子流图A.Negative ion mode B.Positive ion modeFig.1 TIC chromatogram of FZKAⅡwater extract

2.2 网络药理学分析

成分靶点与疾病靶点确定：使用Swiss TargetPredic⁃tion 数据库及PharmMapper 数据库对128 个化学成分进行靶点预测，剔除未预测到靶点的29个化学成分；其余99个成分共收集到成分靶点271个，去除重复靶点143个，最终得到128 个成分靶点。使用DisGeNET 数据库、GeneCard数据库、OMIM数据库共收集到疾病靶点933个，去除重复靶点138个，最终得到疾病靶点795个。

关键靶点确定：取128 个成分靶点和795 个疾病靶点相互映射，通过绘制维恩图，获得FZKAⅡ方干预结肠癌的关键靶点33个。详见图2。

图2 FZKAⅡ方治疗结肠癌的关键靶点维恩图Fig.2 Venn diagram of the key targets of FZKA Ⅱin the treatment of colon cancer

PPI 网络构建：利用Cytoscape 3.9.1 平台对String 11.5 数据库分析结果进行可视化，连线越紧密、颜色越深说明靶点在网络中越重要，排名前10 的靶点分别为丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、雌激素受体1（ESR1）、SRC 表皮生长因子受体（EGFR）、前列腺素内过氧化物酶2（PTGS2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶- 2（MMP - 2）、激酶插入域受体（KDR）、胰岛素样生长因子受体1R（IGF1R）、CCNB1，提示上述靶点可能是FZKAⅡ方治疗结肠癌的核心靶点，见图3。

图3 FZKAⅡ方治疗结肠癌关键靶点的PPI网络Fig.3 PPI network of key targets of FZKA Ⅱin the treatment of colon cancer

关键靶点的GO 富集分析和KEGG 通路富集分析：使用Omicshare 平台对33个关键靶点进行GO 富集分析与KEGG 通路富集分析，并对前20 条富集分析结果进行可视化。由图4A可知，生物过程主要涉及生物质量的调节（GO：0065008）、压力反应的调节（GO：0080134）、对程序性细胞死亡的调节（GO：0043067）等；分子功能主要涉及离子结合（GO：0043167）、催化活性（GO：0003824）、小分子结合（GO：0036094）等；由图4B 可知，细胞组成主要涉及质膜区、质膜部分、膜部件等；由图4C可知，FZKAⅡ方治疗结肠癌的通路主要有癌症通路、人类巨细胞病毒感染、癌症中的MicroRNAs、癌症中的蛋白聚糖、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路等。

A.生物过程与分子功能 B.细胞组成 C.KEGG通路富集分析图4 FZKAⅡ方治疗结肠癌的关键靶点的GO富集分析与KEGG通路富集分析A.Biological processes and molecular functions B.Cell composition C.KEGG pathway enrichment analysisFig.4 GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of key targets of FZKAⅡin the treatment of colon cancer

活性成分-关键靶点-通路网络构建：将PPI网络筛选出的关键靶点与成分靶点相关联，剔除与关键靶点无相互作用的成分，最终得到22 个活性成分与33个关键靶点相关，选择前20个成分并结合前20条通路，构建活性成分-关键靶点-通路网络（图5）。结果显示，癌症通路富集8 个靶点，癌症中的MicroRNAs 富集6 个靶点，癌症中的蛋白聚糖富集5 个靶点；其中，与成分、通路关联性较强的前5 个靶点为糖原合酶激酶3B（GSK3B）、SRC、MMP-9、蛋白酪氨酸激酶2（PTK2）、细胞色素P4501B1（CYP1B1）。

图5 FZKAⅡ方治疗结肠癌的活性成分-关键靶点-通路网络Fig.5 Active ingredients - key targets - pathway network of FZKAⅡin the treatment of colon cancer

2.3 分子对接结果

槲皮素、芹菜素、木犀草素、山柰酚、染料木素和关键靶点的关联性较强，故选取以上5 个核心成分分别与关键靶点进行对接。由图6可知，结合能小于-7 kcal/mol的有20 种（83.33%），位于-7～-5 kcal/mol 的有4 种（16.67%）。小于-5 kcal/mol的表示结合活性良好［21］，占100%。选取结合活性强的成分和靶点对接结果进行可视化，结果显示，FZKAⅡ方的活性成分治疗结肠癌具有较好的活性。详见图7。

注：黄色“0”表示未对接。图6 FZKAⅡ方治疗结肠癌的核心成分与关键靶点对接结果Note：Yellow "0" refers to no molecular docking.Fig.6 Molecular docking results pf key components and targets of FZKAⅡin the treatment of colon cancer

A.槲皮素和糖原合酶激酶3B（GSK3B）对接 B.芹菜素和PTGS2 对接 C.木犀草素和MMP - 9 对接 D.山柰酚和多药耐药性蛋白1（ABCB1）对接 E.染料木素和雌激素受体2（ESR2）对接注：绿色为化合物，荧光蓝为氨基酸残基，黄色虚线为氢键。图7 FZKAⅡ方治疗结肠癌的核心成分与关键靶点对接结果的可视化A.Molecular docking of quercetin and GSK3B B.Molecular docking of apigenin and PTGS2 C.Molecular docking of luteolin and MMP - 9 D.Molecular docking of kaempferol and ABCB1 E.Molecular docking of genistein and ESR2Note：Green refers to chemical components，fluorescent blue refers to amino acid residues，and yellow dashed lines refer to hydrogen bonds.Fig.7 Visualization of the molecular docking results between the key components and targets of FZKAⅡin the treatment of colon cancer

3 讨论

FZKAⅡ方中，党参、五爪金龙、白术、制仙茅共为君药，健脾益气，温肾壮阳，共同补益先后天之本，扶助正气；茯苓、薏苡仁、法半夏、浙贝母、杜衡、山海螺和菝葜共为臣药，利湿导滞，清利肠中湿热，消痞散结；陈皮、青皮共为佐药，理气破气，补而不滞，抗邪与扶正兼顾。

本研究中通过高分辨质谱技术分析FZKAⅡ方的成分，共鉴定出化学成分128 个，其中黄酮类占比最大（27.34%），表明黄酮可能是FZKAⅡ方的主要活性成分。另有文献报道，类黄酮的摄入可能通过抗过氧化、抗氧化和抗炎作用而降低结直肠癌的发病率和复发风险；黄酮类化合物还可调节线粒体功能，平衡细菌菌群，促进癌细胞凋亡，通过干扰多种信号转导途径，抑制癌细胞的增殖、血管生成及癌细胞的转移，促进其凋亡等［22-23］。此外，通过网络药理学对128个化学成分预测的靶点与结肠癌疾病靶点绘制维恩图得到33个共同靶点，即为FZKAⅡ方治疗结肠癌可能的关键靶点。通过与成分、通路相关联，发现槲皮素、芹菜素、木犀草素、山柰酚、染料木素和关键靶点的关联性较强，上述成分均来源于五爪金龙，表明五爪金龙可能是治疗结肠癌的核心药材，与方剂组方特点一致。据报道，食用富含槲皮素的洋葱可降低胃癌、结肠癌、直肠癌的患病风险，尤与结肠癌的发病率呈正相关［24］。山柰酚在多种类型的癌细胞中发挥细胞毒作用，可诱导SW480 人结肠腺癌细胞凋亡，具有潜在的抗癌作用［25-28］。终生摄入染料木素可降低由偶氮甲烷诱导的大鼠结肠癌病变的发生率和频率［29］。以上研究结果均表明，槲皮素、芹菜素、木犀草素、山柰酚和染料木素等可能是FZKAⅡ方治疗结肠癌的主要活性成分，为FZKAⅡ方治疗结肠癌的作用物质基础研究提供了方向。

GSK3B，SRC，CYP1B1，MMP - 9，PTK2 与成分、通路关联性较强，表明其可能是FZKAⅡ方干预结肠癌的核心靶点。有研究表明，抑制GSK3B 的表达可进一步抑制肿瘤生长，同时还可诱导结肠癌细胞凋亡［30-31］。SRC基因编码一种与癌症相关的非受体酪氨酸激酶SRC 家庭激酶（SFK），SFK 在肿瘤的发展过程中通过影响肌动蛋白、Ras/ 细胞外调节蛋白激酶/ 丝裂原活化蛋白激酶（Ras/ERK/MAPK）途径，以及EGFR 和血管内皮生长因子（VEGF）受体等在细胞黏附、侵袭、增殖、存活和血管生成中起关键作用［32］。MMP-9参与了蛋白激酶C通路的激活，其过表达与乳腺癌和结肠癌患者的生存率下降和癌细胞转移直接相关［33-34］。与正常组织相比，CYP1B1 mRNA 分别在65%和60%的膀胱和结肠肿瘤中存在过表达现象，且在不同来源的人类结肠癌中检测到CYP1B1 mRNA 的差异过表达，故CYP1B1 被认为是潜在的肿瘤标志物和癌症治疗的确切靶点［35-39］。槲皮素与CYP1B1 和GSK3B 等同时靶向，且有报道指出，槲皮素的抗癌作用可能是通过其与多种受体的结合，尤其是与芳香烃受体（AhR）的结合。AhR 是一种配体门控转录因子，参与调控CYP 1家族的表达，CYP1B1作为CYP1的亚型，其过表达导致CYP1激活［35］，故推测槲皮素可能是干预结肠癌的主要因素之一。以上结果均表明，GSK3B，SRC，CYP1B1，MMP - 9 可能是FZKAⅡ方治疗结肠癌的重要靶点。

GO 富集分析和KEGG 通路富集分析结果显示，FZKAⅡ方治疗结肠癌与癌细胞中的MicroRNAs、蛋白聚糖、人类巨细胞病毒感染等相关。在恶性肿瘤中，蛋白聚糖可调节癌细胞的表型、耐药性及肿瘤间质中血管的生成，肿瘤间质的广泛重塑与蛋白聚糖表达和其结构变异显著相关［40］。蛋白聚糖在结肠癌中过度表达和分泌，通过与巨噬细胞表面的Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）结合而激活TLR2/4 信号通路，释放炎性因子白细胞介素1R（IL-1R）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）［41-42］；TLR2/TLR4 信号传导的启动促进了癌细胞的生长，下调了细胞凋亡，上调了肿瘤和基质细胞对生长因子和炎症相关细胞因子的合成［43-45］，表明蛋白聚糖活性具有促癌作用。有研究发现，人类巨细胞病毒感染与结肠癌发生风险显著相关［46］，结肠癌细胞系感染人类巨细胞病毒后表型显著改变，与结肠癌细胞增殖和迁移相关的Wnt 信号通路在感染人类巨细胞病毒的细胞中显著上调［47］。MicroRNAs 在肿瘤发生、发展、血管生成、转移及化学药物治疗耐药中显著相关，MicroRNAs 谱的改变与结肠癌的转化和癌细胞转移有关［48］。以上结果均表明，FZKAⅡ方可能通过癌症通路，癌症中的MicroRNAs、蛋白聚糖，人类巨细胞病毒感染等信号通路发挥治疗结肠癌的作用。

综上所述，本研究中采用UHPLC - Q - Orbitrap MS/MS法鉴定出FZKAⅡ方中128个化学成分，其中以黄酮类成分最多，提示黄酮类成分可能是FZKAⅡ方治疗结肠癌的主要作用物质基础；采用网络药理学对128个化学成分进行分析，得到GSK3B，SRC，CYP1B1，MMP-9，PTK2 5 个核心靶点，其可能通过癌症通路、癌症中MicroRNAs、癌症中的蛋白聚糖或人类巨细胞病毒感染等信号通路发挥治疗结肠癌的作用，但具体作用机制有待进一步验证。