淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中应用的专家共识*

中国医药质量管理协会医学检验质量管理专业委员会

血液肿瘤是起源于造血系统的恶性肿瘤,具有高度异质性。2022版《造血与淋巴组织肿瘤WHO分类》根据肿瘤细胞的来源,将血液肿瘤主要分为髓系增殖和肿瘤、髓系/淋系肿瘤和其他谱系未定白血病、组织细胞/树突状细胞肿瘤、B淋巴细胞增殖性疾病和肿瘤、T淋巴细胞增殖性疾病和肿瘤、NK细胞肿瘤、淋巴组织间质源性肿瘤、遗传性肿瘤综合征8个大类。血液肿瘤的发生、发展和转归与其患者机体的免疫功能,尤其是细胞免疫功能密切相关[1-2]。随着疾病的发生发展,免疫微环境也随之发生相应变化,进而引起外周血中各种免疫细胞的改变。淋巴细胞是构成人体免疫系统的主要细胞,根据标记物和功能的不同,可以分为许多群体。临床上常用流式细胞术(FCM)对外周血中的不同群体的淋巴细胞进行鉴别和计数,包括CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+辅助/诱导T淋巴细胞、CD3+CD8+抑制/杀伤T淋巴细胞、CD3-CD19+B淋巴细胞、CD3-(CD16+CD56)+NK淋巴细胞,简称为TBNK,以及CD3+CD4+CD25+CD127low/-调节性T细胞(Treg)[3]等。本共识中将TBNK和Treg统称为淋巴细胞亚群。血液肿瘤作为造血干细胞异常的恶性肿瘤,疾病的多种因素会影响免疫细胞的产生、增殖及分化,使外周血的淋巴细胞数量与功能产生异常[4],导致免疫功能失调[5-6],因此对血液肿瘤患者进行规范的淋巴细胞亚群检测十分必要。

为了规范淋巴细胞亚群检测中的实验方案、技术操作,使更多相关领域的临床、科研和实验室技术人员认识到淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤患者诊断、预后评估、治疗指导中的作用及注意事项,进一步促进其在血液肿瘤中的应用,中国医药质量管理协会医学检验质量管理专委会结合文献学习和多家医疗机构的临床工作实践制定了本专家共识。

1 淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中的意义

1.1血液肿瘤的发生、进展、预后与免疫功能的关系 正常情况下,免疫系统对肿瘤细胞有监视和清除作用,维持机体内环境的稳定。免疫功能异常可能会导致细胞免疫和体液免疫失调,从而为肿瘤的发生和发展提供条件[7-9];在病原体感染时免疫系统也会受到影响,当免疫功能下降时,肿瘤发生的风险增加[10-11]。文献报道急性白血病、B细胞淋巴瘤等患者常见外周血T细胞数量及CD4+/CD8+比值下降,并伴免疫功能紊乱[12-13]。Treg的主要功能是抑制自身免疫应答,维持免疫平衡,避免过度的炎症反应和自身免疫性疾病的发生,在免疫系统中发挥重要的负向调控作用。在血液肿瘤中,Treg一方面可以通过抑制对肿瘤细胞的免疫反应来促进肿瘤生长;另一方面也可通过抑制炎症和防止可能导致肿瘤发展的自身免疫反应而发挥保护作用。研究发现,多种类型的血液肿瘤患者Treg数量呈现上升趋势,可能会导致肿瘤免疫逃逸的发生[14-15]。此外,一些淋巴细胞产生的细胞因子,如白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等,在血液肿瘤患者中异常表达,进一步说明了机体免疫功能异常和血液肿瘤之间关系密切[16-18]。近年来,一些新型的免疫治疗策略也在血液肿瘤的诊疗中发挥日益重要的作用,例如采用免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗、双重特异性抗体治疗等[19-22],这些治疗手段主要是通过增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,来达到治疗目的。

1.2淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中的临床意义 淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中的临床应用主要包括以下方面。(1)部分血液肿瘤的筛查。血液肿瘤包括多种类型,其中一些类型可表现为特定淋巴细胞亚群的增殖和分化异常,通过淋巴细胞亚群检测可以对这些类型的血液肿瘤进行初筛。如急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞增殖性疾病(CLPD)等[23]。(2)肿瘤复发、转移预警及预后评估。Treg在多种血液肿瘤中比例增加,可以通过抑制免疫细胞杀伤作用来帮助肿瘤细胞逃脱免疫监视,并且与恶性程度、转移倾向、复发率等预后指标密切相关[24-26]。(3)合并感染风险预警。(4)造血干细胞移植治疗患者的免疫重建评估与移植物抗宿主病(GVHD)预防。Treg可以作为急性和慢性GVHD的生物标志物[27-29]。(5)CAR-T治疗患者的规范化管理和评估。(6)靶向药物、免疫抑制剂和化疗药物的治疗指导,疗效监测[30-31]。

2 淋巴细胞亚群检测的主要方法和结果报告

2.1外周血淋巴细胞亚群检测的主要方法 淋巴细胞亚群主要通过FCM进行检测。根据中华人民共和国卫生行业标准(WS/T 360-2011)《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》[32],FCM检测淋巴细胞亚群时,可以采用双平台法或单平台法。首选乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝真空管进行外周静脉血标本采集,并在24 h内进行检测。送检时间超过30 h应该采用肝素钠或枸橼酸钠抗凝,可在室温下稳定保存至48 h,若用双平台法,应采用淋巴细胞亚群检测同一标本进行白细胞计数和分类,应该选择 EDTA-K2作为抗凝剂。若送检时间超过48 h,应该使用流式细胞检测专用的样本保存液或样本保存管,可稳定保存至14 d。TBNK检测推荐的单抗为CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56,Treg检测的单抗为CD4、CD25、CD3、CD127。CD3+T细胞标记为CD3+,CD4+T细胞标记为CD3+CD4+,CD8+T细胞标记为 CD3+CD8+,B细胞标记为CD3-CD19+,NK细胞标记为CD3-(CD16+CD56)+,Treg细胞的标记为CD3+CD4+CD25+FoxP3+或CD3+CD4+CD25+CD127low/-。T细胞表面CD127的低表达与T细胞质内FoxP3的高表达具有良好的相关性[33-35],且以CD127为标记的检测方法明显优于以细胞质内FoxP3为标记的检测方法[36-38],因此也可以使用CD127替代FoxP3进行Treg细胞的分析。上机检测前应采用配套的标准微球对仪器进行全程质控。推荐每管获取淋巴细胞数应不小于10 000个,得到的检测数据可通过调整荧光补偿、圈门等将各种不同表型的淋巴细胞亚群区分开[39-41],进而得到各群细胞的相对比例及计算绝对数。推荐同时报告淋巴细胞亚群的百分比和绝对计数结果。

2.2外周血淋巴细胞亚群检测的结果报告 通常应报告以下内容:CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞的相对计数(百分比)和绝对计数(绝对值)、CD4+/CD8+比值、Treg细胞占CD4+T细胞的百分比。

2.2.1外周血淋巴细胞亚群检测的参考区间 近年来已有多篇文献发布了我国不同地区、年龄、民族健康人群的TBNK、Treg细胞参考区间[42-46]。在2023年2月中华医学会健康管理学分会发表的《TBNK淋巴细胞检测在健康管理中的应用专家共识》中公布了一项对我国九省(湖北、河南、广东、吉林、山东、山西、江苏、浙江、四川)20～60岁健康成人TBNK淋巴细胞参考区间的研究结果[45,47],可供参考,见表1。

表1 我国九省健康成人TBNK淋巴细胞检测参考区间

在2017年一项研究中发布了健康成年人外周血Treg细胞参考区间[48],可供参考,见表2。由于Treg在多种疾病的临床治疗与疗效观察方面具有重要探讨价值,近年来许多国内实验室均报告了疾病观察组与健康对照组中外周血Treg细胞占CD4+T细胞的参考区间,如张宁等[49]报道了健康对照组参考区间为(4.52 ± 0.50)%,陈赛英等[50]报道了健康对照组参考区间为(6.85 ± 1.86)%,XU等[51]报道了健康成人的参考区间为(5.52 ～ 7.70)%,QIU等[52]报道了健康对照组参考区间为(5.70 ± 1.43)%。

表2 健康成年人外周血Treg细胞参考区间(%)

淋巴细胞亚群参考区间的建立受年龄、性别、种族、地域及仪器试剂等众多因素影响[47],建议有条件的实验室可以针对本地区、本实验室检测体系等建立自己的参考区间及评价体系。调查健康人群淋巴细胞亚群的参考范围,建立95%置信区间的参考值区间,应满足每组至少120例健康样本数量[53]。此外,鉴于人员、仪器、试剂、方法、环境等诸多变化因素,实验室应对已建立的参考区间定期进行验证,每次验证应不少于20例健康样本,分布在参考区间外的测定值应不超过10%[32,53]。若分布在参考区间外的测定值超过10%,则需要重新验证或考虑实验室分析程序、人群差异等其他因素。

2.2.2外周血淋巴细胞亚群检测报告的审核和发布 进行淋巴细胞亚群检测的实验室都应该参加国家卫生健康委员会或省市级临检中心组织的室间质评,从而保证本室检测结果的准确性。在检测患者样品前,实验室人员应确认仪器状态正常和室内质控在控。在报告结果时,实验室人员要审核数据采集阈值的设置、抗体的组合方案、与实验结果相关的所有设门等,以排除样本异常和实验操作导致的检测结果异常。实验室人员还应根据检测结果的内部关系初步判断结果的可靠性。例如,数据应满足:CD3+%+CD19+%+(CD16+CD56)+% ≈(100±5)%;CD4+%+CD8+% ≈ CD3+% (变化范围为5%～10%)[32]。若不满足,则需充分检查,必要时重复实验,在排除仪器、样品、操作等问题后如实报告检测结果,并需要重点分析该样本中是否存在异常表型的淋巴细胞,同时用该样本制作血涂片镜检及进一步进行免疫分型对异常细胞进行鉴定,及时与临床进行沟通。目前,由于国内没有针对Treg细胞检测项目的室间质评,因此应进行实验室间比对。

3 淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤患者中的应用

3.1血液肿瘤的筛查 当出现以下情况:(1)B或NK淋巴细胞显著增高;(2)CD3+CD4+CD8+T淋巴细胞或CD3+CD4-CD8-T淋巴细胞明显增高;(3)CD4+/CD8+比值大于10∶1或小于1∶10;(4)CD3+%+CD19+%+(CD16+CD56)+%明显大于或小于(100±5)%、CD4+%+CD8+%明显大于或小于CD3+%(变化范围为5%～10%),在排除标本、仪器、设门、试剂及反应性改变等因素后,需要考虑标本中存在异常淋巴细胞,并结合临床进行血液肿瘤的筛查。血液肿瘤常见的淋巴细胞亚群改变见图1,血液肿瘤淋巴细胞亚群筛查与随访路径见图2。

注:MICM表示形态学、免疫学、细胞遗传学及分子生物学分型。

3.2血液肿瘤的复发、转移风险预警及预后评估 当血液肿瘤患者外周血中出现CD4+T和CD8+T细胞减少,CD4+/CD8+比值降低,而Treg细胞明显增加时,提示肿瘤复发和转移的风险增加;CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞的数量和比例与患者的完全缓解(CR)率、无复发生存期(RFS)和总生存期(OS)呈正相关,而Treg的数量和比例与CR率、RFS和OS呈负相关[54-58]。在急性髓系白血病(AML)患者中,NK细胞数量和比例与CR率、RFS、OS呈正相关[59],NK细胞数量减少的AML和多发性骨髓瘤(MM)可能有更差的预后[60-61]。

3.3血液肿瘤合并感染风险预警 感染是血液肿瘤患者的常见并发症[62],CD4+T淋巴细胞在免疫防御中发挥关键作用。当CD4+T淋巴细胞绝对计数<500个/μL时,血液肿瘤患者机会性感染风险会大幅升高[63]。CD4+T、CD8+T淋巴细胞数量低下的淋巴瘤患者,化疗后感染风险明显升高[64]。初诊时Treg细胞比例升高的血液肿瘤患者,其住院期间感染率明显增加[65]。

3.4造血干细胞移植后免疫重建监测及GVHD预防

3.4.1移植患者免疫重建监测 造血干细胞移植(HSCT)后造血能力持久恢复与免疫系统功能调节密切相关,主要表现为免疫细胞数量的增加和细胞功能状态的恢复[66-67]。免疫重建受移植物来源、移植物数量与组分、预处理方案、胸腺功能等众多因素影响,但自体造血干细胞移植和异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)患者外周血中TBNK、Treg细胞的重建规律基本相似。NK细胞恢复较快,一般移植后2～3周可恢复。CD3+CD8+T淋巴细胞一般移植后1～3月逐渐恢复,CD3+CD4+T淋巴细胞恢复通常需1年以上。CD3-CD19+B淋巴细胞移植后恢复时间不定,短至3个月,长至1年半以上。Treg细胞在移植早期通常比例非常低,移植晚期逐渐增多。

3.4.2移植患者GVHD预防 GVHD是allo-HSCT患者需要面临的重要挑战。发生GVHD的患者,其疾病及移植相关死亡率大幅上升,尽早判断是否发生排异反应及抢先治疗是决定移植成败的关键。高炎症状态是GVHD的主要特点[68-69]。具有负调控炎症反应功能的Treg细胞随GVHD等级的增加呈下降趋势,有望成为预测急性GVHD(发生于移植后100 d内)和慢性GVHD(发生于移植100 d后)的特异性指标[70-71]。同时,植移后NK细胞迅速增加会促使炎症因子的大量分泌,从而促进急性GVHD发生[72-73]。因此allo-HSCT患者在早期植入阶段(输注后2～4周)、移植后早期阶段(输注后1～3月)、移植后晚期阶段(输注后3月以后)都建议行淋巴细胞亚群检测。

3.5CAR-T治疗患者的规范化管理和评估

3.5.1CAR-T细胞增殖监测 CAR-T细胞免疫治疗目前已被用于治疗复发/难治性的血液肿瘤。定期监测CAR-T治疗患者体内的CAR-T细胞水平、肿瘤负荷、免疫功能(主要包括淋巴细胞亚群的比例和数量)和相关不良反应(细胞因子释放综合征、神经毒性等),是治疗后病情评估的重要手段[74-75]。患者回输CAR-T细胞后,可通过FCM监测外周血中CAR-T细胞的比例和数量,结果报告中一般包括总CAR-T细胞(占淋巴细胞)、CD4+CAR-T细胞(占T淋巴细胞)和CD8+CAR-T细胞(占T淋巴细胞)的比例和数量。有条件的实验室还可开展荧光定量聚合酶链反应法(qRT-PCR)监测CAR-T细胞增殖水平。多项临床试验数据显示,体内CAR-T细胞增殖水平与疗效显著正相关[76-78]。

3.5.2淋巴细胞亚群监测 淋巴亚群检测也被推荐与CAR-T细胞监测同时进行[75]。有研究通过检测患者CAR-T细胞回输后第15天的外周血淋巴细胞水平,发现低水平的淋巴细胞数(<0.67×109/L)是患者的不良预后因素,显著影响病情缓解[79]。也有研究发现缓解患者CAR-T细胞回输2年后的CD4+T淋巴细胞数仍低于0.20×109/L[80]。有研究者提出,具有中央记忆T细胞和干细胞样记忆T细胞表型的CAR-T细胞,在体内有更强的增殖能力及更持久的抗肿瘤效应[80-81]。对于CAR-T细胞治疗的患者,有条件的情况下,可以进行CAR-T细胞的精细亚群分析和长期随访。

3.6血液肿瘤患者药物治疗指导

3.6.1CD20单抗 CD20单抗可靶向治疗B淋巴细胞型非霍奇金淋巴瘤,单次输注CD20单抗后3 d内,患者外周血B淋巴细胞可减少90%[82],多数患者这种剂量依赖性B细胞减少状态将持续2～3个月,一般6个月后患者外周血B淋巴细胞恢复[83-85]。B细胞是否完全清除可用于评估CD20单抗的治疗反应和疗效[86-88]。若患者在使用CD20单抗治疗后,外周血B细胞计数未出现明显减少或无剂量依赖,提示患者对CD20单抗治疗低反应,则可考虑更换治疗方案[89]。

3.6.2免疫调节药物 (1)对于免疫功能严重受损的患者(经过放化疗治疗或合并HIV感染等)[90-91],患者在治疗过程中发生严重感染的频率显著增加。当患者CD4+T细胞绝对计数小于100个/μL时,建议停用免疫抑制药,使用胸腺五肽[92]等免疫增强剂,待患者免疫功能恢复后在进一步治疗。当小于200个/μL时,需注意免疫抑制药剂量。(2)对于移植及个体化免疫治疗患者,当CD4+/CD8+细胞比值出现小于0.2时,建议停用免疫抑制药,而CD4+/CD8+细胞比值小于0.5时,需谨慎用药,并密切关注患者免疫功能状态及感染情况。(3)对于治疗期间合并感染的患者,NK细胞或CD8+T细胞绝对值及比例较治疗前明显升高[93],提示可能伴有病毒感染,可为抗病毒药使用提供参考。

3.7动态监测与随访时机的选择

3.7.1建立基线,动态监测 淋巴细胞亚群检测结果受疾病状态、药物等因素影响,采用健康人群参考区间可能不能有效评估血液肿瘤患者免疫功能,建议建立患者个体化的淋巴细胞亚群检测结果的基线,并规律、动态的监测其变化趋势。有条件的单位,可在报告中呈现结果动态变化的趋势图。

3.7.2初诊时患者的淋巴细胞亚群检测 血液肿瘤患者常伴有免疫功能失衡,细胞免疫功能往往处于免疫抑制状态,对肿瘤细胞的识别和杀伤能力下降[94-95]。检测初诊时患者的淋巴细胞亚群,能有效判断患者免疫功能的初始状态。

3.7.3放化疗、免疫治疗及靶向治疗患者的淋巴细胞亚群监测与随访 放化疗、免疫治疗及靶向治疗期间患者淋巴细胞亚群可呈周期性改变[96],可通过检测患者每个周期治疗前后的淋巴细胞亚群变化,来评估患者治疗期间免疫功能恢复情况及肿瘤复发和转移的风险。建议有条件的情况下,在治疗结束后半年内每3个月跟踪检测,半年后每6个月进行随访。

3.7.4造血干细胞移植患者的淋巴细胞亚群监测与随访 建议造血干细胞移植后患者的淋巴细胞亚群检测时间可在移植后第14天、第21天、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年随访[97-101]。

3.7.5CAR-T治疗患者的淋巴细胞亚群监测与随访 建议连续监测患者CAR-T细胞回输前1天、回输后第4天、第7天、第14天、第28天外周血淋巴细胞亚群变化情况,及治疗后2个月、3个月、6个月随访。见图3。

图3 血液肿瘤淋巴细胞亚群检测与随访路径图

4 结 语

随着流式细胞术的广泛应用,用于免疫功能评价的淋巴细胞亚群检测在临床已广泛开展,通过TBNK、Treg这些指标,可以评估血液肿瘤患者免疫状况,为疾病诊断、分型,治疗方案的选择、化疗后感染预防,疾病转归预测等提供实验室依据,以及为血液肿瘤患者的个性化治疗提供参考。

机体免疫功能受年龄、药物、感染、营养、生理等众多因素的影响,存在较大的个体差异。机体免疫功能是动态变化的,同一患者的不同疾病状态下淋巴细胞亚群检测结果也可能出现较大的波动。因此,淋巴细胞亚群检测在参考范围的建立、报告结果解读等方面依然存在挑战。

针对血液肿瘤患者,临床工作中需要建立患者个体化的淋巴细胞亚群基线水平,动态监测淋巴细胞亚群结果的变化趋势,并结合多种免疫功能检测指标,综合分析患者的免疫状态,为临床决策提供更加全面的参考。

淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中具有重要的临床意义和广泛的应用前景,本共识的发布将有助于推动淋巴细胞亚群检测临床实践中的应用,促进血液肿瘤的诊断、治疗和预后评估水平的提高,期望能够为我国血液肿瘤的精准诊疗做出贡献。

专家组组长:杨再林(重庆大学附属肿瘤医院)、武坤(昆明医科大学第一附属医院)、刘耀(重庆大学附属肿瘤医院)

执笔人(按姓氏汉语拼音排列):陈双(重庆大学附属肿瘤医院)、程沈菊(昆明医科大学第一附属医院)、蒋亭亭(重庆大学附属肿瘤医院)、李轶勋(昆明医科大学第一附属医院)、刘耀(重庆大学附属肿瘤医院)、彭余(重庆大学附属肿瘤医院)、武坤(昆明医科大学第一附属医院)、杨再林(重庆大学附属肿瘤医院)

专家组成员(按姓氏汉语拼音排列):陈曼(北京陆道培医院)、陈朴(复旦大学附属中山医院)、池沛冬(中山大学肿瘤防治中心)、蒋能刚(四川大学华西医院)、李力(南部战区总医院)、李珍(南方医科大学南方医院)、李国盛(山东大学齐鲁医院)、李智伟(新疆维吾尔自治区人民医院)、刘耀(重庆大学附属肿瘤医院)、刘艳荣(北京大学人民医院)、马骁(苏州大学附属第一医院)、毛霞(华中科技大学同济医学院附属同济医院)、倪万茂(浙江省人民医院)、冉隆荣(重庆大学附属肿瘤医院)、任方刚(山西医科大学第二医院)、王卉(河北燕达陆道培医院)、王慧君(中国医学科学院血液病医院)、王剑飚(上海交通大学附属瑞金医院)、翁香琴(上海交通大学附属瑞金医院)、吴丽娟(西部战区总医院)、吴雨洁(江苏省人民医院)、武坤(昆明医科大学第一附属医院)、徐翀(上海市临床检验中心)、杨军军(温州医科大学检验医学院)、杨顺娥(新疆医科大学附属肿瘤医院)、杨再林(重庆大学附属肿瘤医院)、岳保红(郑州大学第一附属医院)、张爱梅(中国科学技术大学附属第一医院/安徽省立医院)、张会来(天津医科大学肿瘤医院)、赵明宇(重庆大学附属肿瘤医院)、朱杰(大连医科大学附属第二医院)、朱莉(华中科技大学同济医学院附属同济医院)、朱明清(苏州大学附属第一医院)、朱明霞(北京大学第三医院)、郑金娥(华中科技大学同济医学院附属协和医院)、周辉(湖南省肿瘤医院)

利益冲突:所有作者声明无利益冲突。