毛刺状淋巴样原始细胞在急性白血病形态学诊断中的价值*

邓小娟,李 艺,张 云,杜雨軒,冯一梅,彭贤贵,王 平,张 曦

陆军军医大学第二附属医院血液病医学中心,重庆 400037

白血病是一组累及造血干/祖细胞的高度异质性血液系统恶性肿瘤,骨髓或外周血中出现大量原始、幼稚或不完全成熟的髓系或淋巴系细胞[1]。白血病细胞具有异质性和多态性特点,细胞形态特征变异性大,白血病精准诊断依赖MICM分型、二代测序技术等多技术的联合应用,但细胞形态学仍是精准诊断环节中最快捷、最经济的基石。虽然,形态检验者的判断符合率仅为64%～77%[2],但是在血液肿瘤细胞形态学的认识上,形态学检验有一些特殊的科学发现,如异常早幼粒细胞形态与染色体t(15;17)易位和PML/RARa融合基因关联,异常中幼粒细胞常常与t(8;21)染色体易位匹配,以及杯状核原始细胞认识让细胞形态与FLT3-ITD、NPM1基因产生了联系[3]。因此,本研究探讨原始细胞呈毛刺状淋巴样改变的急性白血病患者的白血病细胞形态和组化特征与疾病分型、免疫表型的关系,旨在发现更多的具有特殊形态特征的白血病细胞与免疫表型和基因的联系。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究为回顾性分析研究,选取2020年1月至2021年12月在陆军军医大学第二附属医院血液病医学中心初诊为急性白血病的525例患者作为研究对象。研究对象根据骨髓细胞形态学特征筛选出不伴成熟细胞分化的急性白血病,且毛刺状淋巴样原始细胞比例≥5%(定义为毛刺状淋巴样原始细胞型急性白血病)的患者72例作为阳性组;其余研究对象白血病细胞形态规则呈圆形或椭圆形,并且毛刺状淋巴样原始细胞<5%的患者453例为对照组。阳性组中男性48例、女性24例,中位年龄为37.0岁。对照组中男性289例、女性164例,中位年龄为40.1岁。

1.2研究方法

1.2.1骨髓细胞形态学 采集骨髓制片8～10张,外周血制片2张,按《全国临床检验操作规程》[4]中常规方法进行瑞氏-吉姆萨染色。血细胞形态特点和骨髓象诊断意见参照《血液病学诊断及疗效标准》[5],结合临床提供的病史体征及实验室检查得出最终诊断结果。白血病细胞形态特鉴定由3名形态学专家(从事血液病形态学诊断工作10年以上或具有高级职称的形态学检验者)进行分析。

1.2.2细胞化学染色 选取急性白血病骨髓涂片3张进行特殊染色,分别做过氧化物酶(POX)、非特异性酯酶(NAE)染色及氟化钠(NaF)抑制试验,试剂盒均由珠海贝索生物公司生产。过氧化物酶染色结果判读:原始粒细胞呈弱阳性或阴性,后期阶段粒细胞呈阳性;单核细胞呈弱阳性或阴性,而淋巴细胞、浆细胞、有核红细胞、巨核细胞POX染色呈阴性。NAE染色及NaF抑制试验结果:粒系原始细胞和单核细胞NAE染色呈阳性,单核细胞NAE阳性反应能被NaF抑制,粒系不能被NaF抑制。

1.2.3流式细胞免疫分型 采集乙二胺四乙酸抗凝骨髓液2～3 mL,采用流式细胞仪(NAVIOS,购买于贝克曼公司)进行免疫分型,免疫荧光抗体(购买于BD公司)包括CD45、CD34、CD117、CD38、HLA-DR、CD123、CD13、CD33、CD15、CD16、CD14、CD64、CD11c、CD56、CD19、CD10、CD20、CD22、CD7、CD3、CD4、CD8、CD5、CD61、CD71、CD235a、cCD3、cMPO、cCD79a等。以CD45和侧向角散射双参数散点图设门。膜表面抗体表达以超过20%为阳性,胞内抗体以超过10%为阳性[6],流式免疫分型诊断采用WHO诊断标准。从细胞发育理论来讲CD34+CD38-、CD34+CD123+等通常被定义为干/祖细胞阶段标志,在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)中CD34+或c-Kit(CD117+)被认为起源干/祖细胞阶段[7-8]。

1.3统计学处理 采用统计软件SPSS26.0对数据进行分析,计数资料以例数或百分率表示,组间分型、跨系表达及干/祖细胞阶段标志表达比较采用χ2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1阳性组中毛刺状淋巴样原始细胞形态 阳性组中毛刺状淋巴样原始细胞形态特征为细胞直径10～20 μm(1.0～1.5个成熟淋巴的直径大小),外形不规则,细胞质较少呈拖尾状或毛刺状,部分含少许A颗粒,核染色质细,核仁清晰。见图1。

注:A、B为瑞氏-吉姆萨染色,表示阳性组中毛刺状淋巴样原始细胞;C、D为POX染色,◆表示阳性组中形态规则的原始细胞POX染色(阳性)。

2.2两组免疫分型结果比较 525例急性白血病根据WHO诊断标准、细胞形态学、组化染色特征及流式免疫表型的分型结果如下,阳性组中混合表型急性白血病(MPAL)、急性髓系白血病(AML)、急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、T-ALL占比依次为50.0%、27.8%、18.0%、4.20%;对照组中MPAL、AML、B-ALL、T-ALL占比依次为2.4%、72.8%、19.9%、4.9%。两组的WHO诊断标准分型结果进行比较,差异有统计学意义(P<0.05)。进一步分析发现,阳性组中50.0%患者分型为MPAL,而对照组中仅有2.4%患者分型为MPAL,提示阳性组的分型更容易出现MAPL。见表1。

表1 阳性组与对照组的WHO诊断标准分型结果比较[n(%)]

2.3两组中非MPAL及其各亚型的跨系表达情况比较 由于MPAL诊断为髓系与淋系表型混合,为了研究毛刺状形态原始细胞在跨系表达中的价值,因此对非MPAL患者进行了表型比较。两组中非MPAL的各亚型的跨系表达情况比较见表2,阳性组中75.0% AML伴CD7或CD56表达,61.5% B-ALL出现伴CD13或CD33表达,3例T-ALL均出现伴髓系表达,且最终诊断为急性早前T细胞淋巴细胞白血病(ETP-ALL),两组间跨系表达有统计学意义(P<0.05),提示阳性组较对照组更容易出现跨系表达。

表2 两组中非MPAL及其各亚型的跨系表达情况比较[n(%)]

2.4两组患者及其各亚型的干/祖细胞阶段标志表达情况比较 两组患者的干/组细胞阶段标志表达比较差异有统计学意义(P<0.001),提示阳性组出现更高频干/祖细胞阶段免疫标志。进一步对两组中各亚型的干/祖细胞阶段标志表达情况进行分析,阳性组B-ALL和T-ALL的干/祖细胞阶段标志表达与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),提示在阳性组中B-ALL、T-ALL的起源于更早的干/祖细胞阶段。见表3。

表3 两组患者及其各亚型的干/祖细胞阶段标志表达情况比较[n(%)]

3 讨 论

骨髓细胞形态学是诊断白血病的最基本、最重要的手段之一,虽然其诊断符合率不高,但是最快速、最经济的诊断方式。同时,细胞形态学及组化特征也可以在后续的免疫分型、遗传学检查中起到指导作用。本研究骨髓形态诊断实践中发现部分急性白血病细胞呈现非圆形规则形态,白血病细胞呈毛刺状或变异型淋巴样改变,并探讨其细胞形态特征与免疫表型或遗传学的关系。

急性髓系白血病中原始细胞形态常较规则,以圆形或类圆形为主,胞体中等,细胞质偏多,含少许颗粒,形态呈明显粒单原始细胞形态特征,POX染色呈明显阳性,亚型分布主要集中在AML伴成熟分化型(AML-M2/M3/M4/M5b)。本研究发现部分急性白血病中检出多少不一的毛刺状原始细胞,其细胞大小与淋巴细胞相似或稍大,细胞边缘呈毛刺状改变或有拖尾现象,细胞质少或含少许A颗粒,POX染色常呈阴性或极弱点状阳性,阳性率常在1%～10%。POX染色检测髓过氧化物酶,为髓系明确的分化标志[9],但这类急性白血病细胞向下分化特征不明显,后期成熟粒单细胞占比极少,根据形态学特征进行FAB分型较困难或诊断为AML(主要集中在AML-M0/M1/M5a)。

白血病细胞形态的总体趋势与白血病的特定亚型或免疫表型有关。本研究结果显示,阳性组中50.0%患者分型为MPAL,而对照组中仅有2.4%患者分型为MPAL,提示阳性组的WHO诊断标准分型更容易出现MAPL。同时,非MPAL类型的毛刺状淋巴样原始细胞型急性白血病更高频出现跨系表达现象(72.22 %vs.34.61 %)。既往报道,在AML中常见跨系(淋系抗原)表达有CD7、CD4、CD19等,CD7表达在髓系祖细胞上,有调节粒单系细胞集落刺激因子合成并参与细胞分化的作用[10]。有研究者认为伴CD7+AML较伴其他淋系或不伴淋系表达AML的白血病细胞来源于更早期前体细胞,被阻滞在造血发育的早期阶段,形态更原始[11]。在ALL中常见的髓系抗原表达有CD13、CD33、CD15 等[12-13],一般认为伴髓系相关抗原表达的B-ALL起源早于淋巴细胞系定向干/祖细胞,以伴CD33表达最常见,其次为CD66c、CD13、CD15等[14]。ETP-ALL是一类独特的白血病亚型,具有丰富的干细胞和髓系及T淋巴细胞系标志,是一种分化很差、发育阻滞早的干细胞白血病[15]。ETP-ALL在T-ALL中占5.5%～35.0%,起源集中在T祖及前体T阶段,而本研究中25例T-ALL,3例毛刺状淋巴原始细胞型T-ALL均诊断为ETP-ALL。以上研究均提示白血病细胞表型出现跨系表达更多起源于更早干/祖细胞阶段。有研究者从细胞发育理论发现,CD34+CD38-为定义为干细胞标志,CD34+CD38+为祖细胞标志[16-19]。本研究结果发现,原始细胞形态呈现毛刺状淋巴样改变的这一类急性白血病的免疫分型主要归为MPAL(50.0%),在非MPAL患者中更高频出现跨系表达和白血病细胞呈现干/祖细胞的表型。毛刺状淋巴样原始细胞的出现提示白血病细胞来源于更早的干/祖细胞阶段,白血病WHO亚型更多归为未分化和极低分化亚型,因此本研究推测毛刺状淋巴样原始细胞可能为白血病干细胞形态特征。既往研究显示MPAL、ETP-ALL和跨系表达急性白血病预后较差,CD7+AML初次诱导化疗CR率低、复发率高等特点,CD56属于黏附分子家族成员,介导细胞之间连接,调节细胞归巢功能,CD56+AML具有更高髓外浸润的风险[20-22]。临床实践中跨系表达的白血病单独针对系别的化疗方案效果不佳,大多数专家建议根据系别积分兼顾髓系及淋系的化疗方案,取得更好预后[23]。

本研究结果显示,白血病细胞外形不规则,呈毛刺状淋巴样改变的这类急性白血病主要集中在MPAL及微/低分化急性白血病亚型,其免疫表型高频表达混合谱系或跨系免疫标志及干/祖标志,揭示在急性白血病中毛刺状淋巴样原始细胞与更早起源的干/祖细胞形态特征建立了联系。快速识别这类特征的急性白血病,对诊断、治疗及预后判断具有重要的临床意义。然而对于毛刺状淋巴样原始细胞形态特征与白血病干细胞分化、基因表达等信息的关系,尚需更进一步的基础研究。