纤维素酶酶解法提取荷叶碱的工艺优化

李诗虹 陈秋如 杨志坚 陈凌华

摘 要： 为优化纤维素酶酶解法提取荷叶碱的工艺条件，采用单因素试验和正交试验相结合的方法，考察纤维素酶添加量、酶解温度、酶解时间和液料比等因素对荷叶碱提取率的影响，得到纤维素酶提取荷叶碱的最佳工艺条件为：纤维素酶添加量2.3  mg·g  -1  ，酶解温度50℃，酶解时间55 min，液料比（mL/g）30  ∶ 1；在此条件下，荷叶碱的提取率可高达0.67%。研究结果可为后续荷叶碱的开发利用提供了积极参考价值。

关键词： 荷叶碱；纤维素酶酶解法；提取；工艺优化

中图分类号： TS 201    文献标志码： A    文章编号： 0253-2301（2023）05-0037-05

DOI：  10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.05.006

Process Optimization of the Extraction of Nuciferine by Cellulase Enzymatic Hydrolysis

LI Shi-hong 1， CHEN Qiu-ru 1， YANG Zhi-jian 2， CHEN Ling-hua  1*

（1. Jinshan College of Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China;

2. College of Agriculture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract：  In order to optimize the process conditions of extracting the nuciferine in lotus leaves by cellulase enzymatic hydrolysis， the effects of the adding amount of cellulase， enzymatic temperature， enzymatic time and the ratio of liquor to material on the extraction rate of nuciferine in lotus leaves were investigated by using the method of combining the single factor test and orthogonal test. The best technological conditions for the extraction of nuciferine in lotus leaves by cellulase were as follows： the adding amount of cellulase was  2.3   mg·g  -1  ， the enzymatic temperature was 50℃， the enzymatic time was 55 min， and the ratio of liquor to material （mL/g） was  30  ∶ 1.   Under these conditions， the extraction rate of nuciferine in lotus leaves could be as high as  0.67 %. The research results could provide positive reference value for the subsequent development and utilization of nuciferine in lotus leaves.

Key words：  Nuciferine； Cellulase enzymatic hydrolysis； Extraction； Process optimization

荷葉为睡莲科植物莲 Nelumbo nucifera  Gaertn.的干燥叶，自古就有“清热解暑、去脂瘦身”的美誉。荷叶药食两用，荷叶碱作为荷叶主要活性成分，具有降脂降糖  [1-2] 、抗肿瘤  [3] 、抑菌、抗病毒  [4] 等药理作用，并作为荷叶质量控制指标收录于中国药典（2020 年版）。我国拥有丰富的荷叶原料资源，有低廉的生产成本和极高的产量，但利用率却很低，大部分被废弃于池塘，给环境保护和经济建设造成极大浪费。随着健康中国的推进实施，以荷叶碱为代表的植物活性物质已成为人们关注热点。高效便捷提取荷叶活性物质荷叶碱，将其应用于食药保健或学术研究等方面，将具有积极的实践意义。

目前荷叶碱的提取方法主要有加热回流法  [5] 、索氏提取法  [6] 、超声波法  [7] 、微波法  [8] 、酶解法  [9] 等。根据荷叶碱易溶于有机溶剂以及酸性介质，常用的浸提剂有乙醇、甲醇、氯仿、HCl水溶液  [10-11] 等，但这些浸提剂原液一般有刺激气味。为高效便捷安全、且能最大程度维持荷叶碱的药理活性，本研究在柠檬酸缓冲溶液的酸性介质中，探索纤维素酶酶解法提取荷叶碱的工艺条件。柠檬酸缓冲溶液常用于食品生产，安全性高。纤维素酶酶解法反应条件温和、通过破坏荷叶细胞壁，有效促进活性内溶物的释放。本研究采用正交试验，优化了影响荷叶碱提取的纤维素酶添加量、酶解温度、酶解时间和液料比等因素，为后续荷叶碱的开发利用提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

河北省雄安县的干荷叶（市购）；荷叶碱标准品、纤维素酶（400  μ·mg  -1  ）、柠檬酸（分析纯）、柠檬酸钠（分析纯），购自福州鼎国生物技术有限公司。

1.2 仪器

数显恒温水浴锅（群安实验仪器有限公司）；紫外可见分光光度计752N（上海仪电分析仪器有限公司）； PHS 3C 酸度计（上海雷磁有限公司）；岛津AUY120电子天平（岛津国际贸易上海有限公司）；拜杰多功能 BJ 150 型粉碎机（德清拜杰电器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 荷叶碱标准曲线的测定   称取荷叶碱标准品10 mg，用pH=5柠檬酸缓冲溶液定容至25 mL，得到400  μg·mL  -1  储备液。移取5 mL储备液定容于 50 mL 容量瓶，得到40  μg·mL  -1  标准母液；吸取0.5、1、1.5、2、2.5、3.0 mL的标准母液，用柠檬酸缓冲溶液定容于25 mL容量瓶，配成不同浓度的荷叶碱标准溶液。用紫外分光光度计于200～400 nm扫描，测定出荷叶碱标准品的最大吸收波长，然后在测得的最大吸收波长处，测定各浓度的荷叶碱标准溶液的吸光度，绘制标准曲线。

1.3.2 荷叶碱提取率的计算方法

荷叶碱的提取率  [10] =  （c×v×n） m  ×100%

式中： c 为荷叶碱浓度，μg·mL  -1 ； V 为样液体积，mL； n 为提取液的稀释倍数； m 为样品质量，g。

1.3.3 荷叶碱提取的工艺流程   结合前人研究  [9，12-13] ，并考虑纤维素酶适宜pH范围，拟定本试验操作流程：称取经干燥、过100目筛的干荷叶粉1 g→液料比（mL/g）30  ∶ 1加入柠檬酸缓冲溶液→纤维素酶2 mg→50℃水浴60 min→室温冷却→离心取上层清液1 mL，加柠檬酸缓冲溶液定容于100 mL容量瓶→分光光度法测定荷叶碱含量。

1.3.4 荷叶碱提取的单因素试验设计   在1.3.3工艺流程基础上，考察以下4个单因素的不同水平对荷叶碱提取率影响。（1）酶添加量：固定酶解温度50℃，酶解时间60 min，液料比30  ∶ 1（mL/g），考察不同纤维素酶用量（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0  mg·g  -1  ）对荷叶碱提取率的影响。（2）酶解温度：固定酶解时间60 min，液料比30  ∶ 1（mL/g），酶用量2.0  mg·g  -1  ，考察不同酶解温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃）对荷叶碱提取率的影响。（3）酶解时间：固定酶解温度50℃，液料比30  ∶ 1（mL/g），酶用量2.0  mg·g  -1  ，考察不同酶解时间（20、30、40、50、60、70、80 min）对荷叶碱提取率的影响。（4）液料比：固定酶解温度50℃，固定酶解时间60 min，酶用量2.0  mg·g  -1  ，考察不同液料比（10  ∶ 1、20  ∶ 1、30  ∶ 1、40  ∶ 1、50  ∶ 1）对荷叶碱提取率的影响。

1.3.5 荷叶碱提取的正交试验设计   根据单因素试验结果，设计四因素三水平正交试验考察酶添加量、酶解温度、酶解时间和液料比对荷叶碱提取率的影响（表1）。

2 结果与分析

2.1 荷叶碱标准曲线绘制

由图1可知，在270 nm处荷叶碱有最大吸收峰，故后续试验选用270 nm作为测定波长。通过测定各荷叶碱标准溶液的吸光度，得到荷叶碱的标准曲线回归方程（图2）： y= 0.049：1 x- 0.012：8  （y 为提取液的吸光度A， x 为提取液的浓度）；其相关系数 R 2 为 0.997：6 ，线性关系良好。

2.2 荷叶碱提取的单因素试验结果

2.2.1 酶添加量对荷叶碱提取率的影响   由图3可知，荷叶碱提取率随着纤维素酶添加量的增大而增大，当纤维素酶添加量为2.5  mg·g  -1  时，荷叶碱提取率达到最大，其后随着纤维素酶添加量的增加，提取率有所降低。当纤維素酶添加量低于2.5  mg·g  -1  时，纤维素酶的增加使其对荷叶细胞壁的降解作用加剧，有利荷叶碱的溶出释放，所以荷叶碱的提取率会逐渐升高；当纤维素酶与底物的反应达到饱和状态时，荷叶碱提取率达到高峰；随后由于底物浓度不变，酶量的增加导致酶产生竞争性抑制，使酶促反应效率下降，荷叶碱提取率也略微降低。因此，选取2.3、2.5、2.7  mg·g  -1   作为正交试验中纤维素酶添加量的3个试验水平。

2.2.2 酶解温度对荷叶碱提取率的影响   由图4可知，纤维素酶的最适温度为50℃，当温度低于或高于50℃，酶的反应活性均未达到最大值，荷叶碱的提取率均低于50℃的提取率。低温时（T<50℃），酶活性随温度升高而提高；但过高温度 （T> 50℃）会引起酶蛋白变性，导致提取率下降。故选择45℃、50℃、55℃作为正交试验中酶解温度的3个试验水平。

2.2.3 酶解时间对荷叶碱提取率的影响   由图5可知，荷叶碱提取率在酶解时间60 min时最高，这也是酶促反应的最佳时间。酶促反应需要有个时间过程，使酶与底物充分接触反应，因此酶促时间在60 min 之前，提取率随着酶促反应的趋于完全而不断提升；由于酶活性对时间有依赖性  [14] ，酶解时间大于60 min后，随后时间的增加，酶的催化活性下降，提取率有所降低。故选择55、60、65 min作为正交试验中酶解时间的3个试验水平。

2.2.4 液料比对荷叶碱提取率的影响   由图6可知，当液料比小于30  ∶ 1时，由于荷叶干粉的量较多，该比例下所能溶出的有效成分是有限的，存在剩余物料利用不完全的情况，溶剂不够会导致提取不完全；这时随着溶剂的增加，溶出的有效成分也随之增加。当液料比等于30  ∶ 1时，提取率最高。当液料比大于30  ∶ 1时，过大的液料比降低了提取液的 浓度，导致荷叶碱提取率下降。故选取25  ∶ 1、30  ∶ 1、35  ∶ 1作为正交试验液料比的3个试验水平。

2.3 正交试验结果

由表2可知，影响荷叶碱提取率的因素顺序为C（酶解时间）＞B（酶添加量）＞A （酶解温度）＞ D（液料比）。其中，酶添加量、酶解时间、酶解温度这3个因素对荷叶碱提取率影响极显著，液料比对荷叶碱提取率影响显著（表3）。正交试验结果分析显示，荷叶碱提取的最佳表现组合为A 2B 1C 1D 2。按照此优化后得到的提取条件，再次进行荷叶碱的测定，测得荷叶碱提取率为0.67%。

3 结论

本研究在柠檬酸缓冲溶液的酸性介质中，研究纤维素酶酶解法提取荷叶碱的最佳工艺。纤维素酶酶解法提取荷叶碱，能有效保持荷叶碱的生理活性；提取适宜的酸度条件由食品加工生产中常见的柠檬酸缓冲溶液提供，较一般的盐酸、硫酸或醋酸更加的稳定安全，维持溶液pH值效果好。通过正交试验获得纤维素酶提取荷叶碱最优条件为酶解时间55 min、酶添加量2.3  mg·g  -1  、酶解温度55℃、液料比30  ∶ 1（g  ∶ mL），得到的荷叶碱提取率为0.67 %。该提取方法提取效率高、操作简便易行且安全、对试验条件要求不高，可为后续以荷叶碱为代表的食药功能产品的开发利用提供积极参考价值。

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（责任编辑：柯文辉）