蜡样芽胞杆菌计数及鉴定方法的比较

◎ 陆玉芹，陆 鸣，吴张静，曾世祥，刘晓玉

(南宁市食品药品检验所，广西 南宁 530007)

蜡样芽胞杆菌是一种能形成芽胞的条件致病菌，误食后可引起人畜肠道疾病，出现腹泻型或呕吐型食物中毒。谷物和豆类食品易被蜡样芽胞杆菌污染，其次是蔬菜和乳制品[1-2]。2018—2020年宝鸡市各类食品样品中均有蜡样芽胞杆菌污染的情况，2020年珠海市曾出现一起由蜡样芽胞杆菌引起的家庭聚集性食物中毒事件[3-4]。因此，蜡样芽胞杆菌检测方法的研究与应用对于保障食品安全具有重要意义。

本文参考《食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验》（GB 4789.14—2014）采取MPY涂布法、MPN计数法、显色培养基涂布法3种不同方法对样品中的蜡样芽胞杆菌进行计数并比较是否存在显著性差异，同时采用不同方法鉴定蜡样芽胞杆菌并对比不同方法的优劣。

1 材料与方法

1.1 样品信息

冻干粉中蜡样芽胞杆菌定量分析质控样品，来源于中国检验检疫科学研究院测试评价中心。

1.2 标准菌株

蜡样芽胞杆菌（批号：E0067B，广东环凯微生物科技有限公司）；苏云金芽胞杆菌（批号：E0058B，广东环凯微生物科技有限公司；蕈状芽胞杆菌（批号：2015.57，中国工业微生物菌种保藏管理中心）。

1.3 仪器与试剂

生物安全柜、振荡培养箱、显微镜、全自动微生物鉴定及药敏分析系统（VITER 2）、全自动荧光定量PCR分析仪、甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂、胰酪胨大豆多黏菌素肉汤、蜡样芽胞杆菌显色培养基、蜡样芽胞杆菌生化鉴定盒和蜡样芽胞杆菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）。

1.4 方法

在生物安全柜中无菌开启西林瓶，样品开启后加入5 mL无菌水进行再水化，溶解后吸出放入无菌瓶中，反复用余下的55 mL无菌水清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入无菌瓶中，即得待测样品原液。

1.4.1 蜡样芽胞杆菌计数

①MYP平板计数法。将待测样品原液依次稀释至10-4，将每个稀释度以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接种量分别涂布于MYP琼脂平板和显色培养基，30 ℃培养48 h后进行计数，重复3次。②MPN计数法。将待测样品原液依次稀释至10-4，将每个稀释级的样液各吸取1 mL，分别接种于3管胰酪胨大豆多黏菌素肉汤。30 ℃培养48 h后从各管移取1环菌液划线接种到MYP琼脂平板上，30 ℃培养24 h后观察是否有典型菌落。重复3次。

1.4.2 蜡样芽胞杆菌鉴定

选取MYP及显色培养基平板上典型可疑菌落，按照以下3种方法进行确定。①按照GB 4789.14—2014进行生化实验；革兰氏染色后确定细菌鉴定卡的类型后制备菌悬液。②使用VITEK 2 BCL鉴定卡，通过VITEK2 Compact全自动微生物鉴定系统进行可疑菌的鉴定。③按照《出口食品中蜡样芽孢杆菌快速检测方法实时荧光定量PCR法》（SN/T 3932—2014）[5]使用蜡样芽胞杆菌核酸检测试剂盒（PCR-探针法）进行鉴定，并使用蜡样芽胞杆菌标准菌株、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌标准菌株作为对照。

2 结果与分析

2.1 3种计数方法计数结果比较

选择MYP及显色培养基10-2稀释度平板上的典型菌落进行生化鉴定，均为蜡样芽胞杆菌，蜡样芽胞杆菌计数结果如表1所示。3种方法的检测结果的平均值分别为1 433 CFU·mL-1、2 400 MPN·mL-1和1 566 CFU·mL-1，质控样特性值区间为460～3 100 （CFU·mL-1）/（MPN·mL-1），特征值为1 200 （CFU·mL-1）/（MPN·mL-1），3种方法的计数结果均在特征值区间内。

表1 蜡样芽胞杆菌计数结果统计表

2.2 不同方法鉴定蜡样芽胞杆菌的比较

从表2可以看到不同菌株各项生化实验的结果，蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌在MYP和显色培养基上的菌落形态十分相似，且生化特征区别不大。

表2 菌株传统生化实验结果表

标准菌株及质控样的VITEK 2和PCR-探针法鉴定结果见表3，VITEK 2 Compact的结果均为好的鉴定，但结果显示VITEK2无法分辨蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌，需要通过进一步生化鉴定来区分。根据《出口食品中蜡样芽孢杆菌快速检测方法实时荧光定量PCR法》（SN/T 3932—2014）中3.5结果与报告中的要求，阳性对照Ct值＜30，阴性对照无扩增时，该检测结果有效。本次实验试剂盒中的阳性对照Ct值为16.36，阴性对照无扩增，此次检测结果有效。检测样本Ct值≤35时，报告为蜡样芽胞杆菌阳性，阳性样本按GB/T 4789.14—2014进行确证。在此实验中，PCR-探针法仍旧无法直接区别出蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌，需要按照GB/T 4789.14—2014中的根状生长实验和蛋白质毒素晶体实验来区分蜡样芽胞杆菌和相似菌。

表3 菌株VITEK 2及PCR-探针法结果表

3 结论与讨论

MPN法检测结果精密度及重复性较高，但相比平板计数法，MPN法结果与特征值差距较大，数值较高。有研究表明MPN计数法阳性检出率要明显高于平板计数法，因为MPN法实验的第一步要经过48 h的增菌培养，有利于细菌的修复生长，且MPN法检测限值更低，灵敏度更高，因此它适用于目标菌含量较低的食品[6]。平板法适用于污染较严重，目标菌含量较高的食品中蜡样芽胞杆菌的计数的食品[7]。

VITEK2 Compact和PCR-探针法用时较短就可以初筛出阳性，从获得疑似菌落到获得初筛阳性的结果，VITEK2 Compact大约需要14 h，PCR-探针法用时约3 h，国家标准鉴定法则至少需要48 h。传统国家标准检测方法的优点是设备简单，但实验操作烦琐、耗时较长且受到培养时间的影响。PCR和VITEK2 compact鉴定法操作简便，无需经验丰富的专业人员操作，但检测成本较高，实时荧光PCR技术可快速区分出蜡样芽胞杆菌与其他非芽胞杆菌[8]。但是这3种方法都需要进行根状生长实验和蛋白毒素晶体实验排除蕈状芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌。根状生长实验是挑取菌落划平行直线于营养琼脂平板上，30 ℃培养后观察结果，在日常检验中培养24 h即可观察到蕈状芽胞杆菌呈根状生长的特征，蜡样芽胞杆菌菌株呈粗糙山谷状生长的特征。蛋白质毒素结晶试验，GB 4789.14—2014[9]中的实验是将可疑菌落接种于硫酸锰营养琼脂平板上培养后染色，《出口食品中蜡样芽胞杆菌检测方法》（SN/T 0176—2013）是划线于营养琼脂培养后染色[10]。目的都是产生游离芽胞，以上各种计数和鉴定的方法各自有优缺点，在日常的检验工作中应根据样品状况和检验的要求选择合适的检测方法，方能更有效、准确地完成蜡样芽胞杆菌的检验。