外泌体在肿瘤诊疗中的研究进展

张明文,朱佳斌(综述),张晓峰(审校)

(南方医科大学附属小榄人民医院神经外科,广东 中山 528415)

外泌体(exosome)是哺乳动物细胞释放的一种具有脂质双层膜的细胞外囊泡(extracellular vesicles)。近年来,外泌体受到越来越多的关注和研究,也显示出巨大的临床应用价值。外泌体来源于多泡体(multivesicular body,MVBs),在透射电镜下碟形形态,直径40～100 nm,密度1.13～1.19 g/mL。随着研究的深入,发现携带“货物”(蛋白质、脂质或核酸)的外泌体能够改变受体细胞的功能。外泌体及其货物可用作肿瘤诊断/预后的标志物,以及作为抗肿瘤药物的载体。本研究总结了外泌体在肿瘤微环境细胞间通讯中的作用及其在肿瘤诊疗中的应用。

1 外泌体的生物学特征

1987年,Johnstone等［1］首次发现成熟的绵羊网织红细胞可释放出小囊泡。起初,这个小囊泡被认为是用来去除细胞内容物中的“垃圾”。直到1987年,这种囊泡才在超速离心下获得并命名为外泌体。大多数细胞在生理或病理条件下都能分泌外泌体,如网织红细胞、树突状细胞、B淋巴细胞、血小板、肥大细胞、肿瘤细胞等［2］。外泌体广泛分布于血液、尿液、脑脊液、母乳等多种体液中。

外泌体是由某些脂质、蛋白质和核酸组成的。外泌体形成是早期内体成熟为晚期内体的结果,在此过程中内体将分选的蛋白质和核酸以出芽的形式包裹起来,形成腔内囊泡(intraluminal vesicles),逐渐形成多泡体。随后,多泡体被分泌到细胞外空间形成外泌体或者与细胞内溶酶体融合从而被降解［3］。不同细胞分泌的外泌体主要通过受体-配体相互作用、直接与质膜融合、内吞作用将信息传递给受体细胞。

2 外泌体的检测

随着对外泌体的研究越来越多,外泌体已显示出巨大的潜在应用价值。目前,外泌体的分离方法有超速离心(ultracentrifugation)、聚合物沉淀(polymer precipitation)、基于尺寸的分离(size-Based Isolation)、免疫亲和层析(immunoaffinity chromatography)、exoEasy Maxi试剂盒(QIAGEN)、MagCaptureTM外泌体分离试剂盒、PS亲和法外泌体提取试剂盒(Wako)和MinuteTM高效外泌体沉淀试剂(Invent)。尽管已经开发了多种方法来分离和纯化外泌体,但单一方法具有各种缺点。因此,为了提高外泌体的分离效率,需要结合多种方法对外泌体进行分离纯化,以提高产量和纯度。

外泌体的鉴定包括外泌体特异性标记蛋白的检测和外泌体外部表征的检测。外泌体中均可检测到膜蛋白和细胞质蛋白。外泌体上的一些膜蛋白参与了癌症的发生和发展,因此被用作外泌体分离和纯化的靶点。免疫印迹试验(Western blot)和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是两种常用的外泌体蛋白检测方法。但这些方法存在过程复杂、敏感度低的问题。到目前为止,已经开发了多种新技术来检测外泌体蛋白,包括比色检测(colorimetric detection)、荧光检测(fluorescence detection)、电化学检测(electrochemical detection)、表面等离子体共振检测(surface plasmon resonance detection)、表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering)、CRISPR/Cas系统辅助检测(CRISPR/Cas system-assisted detection)和单外泌体检测(single exosome detection)［4］。外泌体表征技术主要包括生物物理技术和分子技术。生物物理技术包括冷冻电子显微镜(cryo-electron microscopy)、拉曼光谱(raman spectroscopy)、动态光散射(dynamic light scattering)、扫描电子显微镜(scanning electron microscopy)和原子力显微镜(atomic force microscopy)。此外,特定的外泌体膜标记功能化原子力显微镜尖端允许识别和检测单个外泌体中的蛋白质。分子技术包括流式细胞术(flow cytometry)和透射电子显微镜(transmission electron microscopy)。动态光散射技术(dynamic light scattering)、纳米颗粒跟踪分析技术(nanoparticle tracking analysis)和可调电阻脉冲传感技术(tunable resistive pulse sensing)能够对外泌体进行定量分析。这些技术将从内体表征(如膜蛋白、脂筏)和外部表征(形态和粒径)检测外泌体。

3 外泌体在肿瘤诊疗中的应用

3.1在肿瘤诊断中的应用 外泌体可以很容易地从血液、尿液、唾液和脑脊液等大多数体液中获得,可以作为液体活检的工具。外泌体被脂质双层膜包裹的结构使其所携带的“货物”在运输过程中很难被降解,所以,外泌体高度保留了原始的细胞生物学信息。因此,作为液体活检的工具,外泌体比循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA)和循环肿瘤细胞(circulating tumor cells)更具优势。外泌体所含的生物活性分子可以反映肿瘤细胞的病理状态。在一项针对28名健康体检人员、60例慢性肝病患者和90例肝细胞癌患者的外泌体microRNA特征的临床研究中,Cho等［3］发现,与正常肝细胞相比,在肝细胞癌患者的外泌体中发现了49个显着过表达的microRNA。其中,血清exo-miR-10b-5p有成为早期诊断肝细胞癌的一种潜在的生物标志物,其曲线下面积为0.934(敏感度为90.7%;特异度为75.0%;截止值为1.8倍)。另一项研究发现,与健康人员相比,结直肠癌患者的外泌体miR-139-3p表达水平显著下调［5］。而与结直肠癌患者相比,转移性结直肠癌患者中外泌体miR-139-3p表达水平更低［5］。这表明结直肠癌患者血浆中外泌体miR-139-3p表达水平降低可作为结直肠癌早期诊断和转移监测的生物标志物。最近,Lv等［6］发现,与健康对照组相比,乳腺癌患者血清中外泌体miR-17-5p的表达水平降低。外泌体miR-17-5p是一种优于常规血清生物标志物CEA、CA125和CA153高度敏感和特异的乳腺癌生物标志物。越来越多的研究表明,环状RNA(circRNA)在肿瘤发生中起着重要作用。例如,Wu等［7］发现circ_0006156在甲状腺乳头状癌患者的血清外泌体中上调。重要的是,circ_0006156通过miR-1178/TLR4通路促进甲状腺乳头状癌进展。长链非编码RNA(lncRNA)是长度超过200个核苷酸且缺乏编码潜力的调节性非编码RNA,在转录调控、癌症进展和细胞分化等众多生物学过程中发挥着至关重要的作用。Piao等［8］发现,胃癌患者的组织和血浆外泌体中lncRNACEBPA-AS1的水平显着增加。此外,胃癌细胞分泌的外泌体lncRNA CEBPA-AS1可以促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,从而诱导胃癌细胞的恶性进展。另一项研究还表明,胃癌患者的外泌体lncRNA MIAT分泌水平显著高于胃腺瘤患者和健康对照组［9］。蛋白质是外泌体的重要载体,在肿瘤诊断中发挥着重要作用。乳酸脱氢酶C4(lactate dehydrogenase C4,LDH-C4)是一种由LDHC mRNA编码参与多种肿瘤的发生发展的蛋白。Cui等［10］发现治疗组肝细胞癌患者血清和外泌体LDH-C4水平高于初诊组,但低于复发组。因此,血清和外泌体LDH-C4可作为早期诊断的生物标志物。这些发现表明外泌体在肿瘤诊断中具有巨大的应用潜力。

3.2在肿瘤治疗中的应用 目前有大量研究表明介导外泌体生物合成的机制失调是引起肿瘤发生、发展的重要原因。因此,靶向外泌体生物合成是一种很有前途的肿瘤治疗策略。中性磷酸脂酶2(neutral sphingomyelinase-2,nSMase2)是将鞘磷脂转化为神经酰胺的关键酶,已被证实参与外泌体的合成。最近有研究表明,非竞争性nSMase2抑制剂GW4869通过抑制肿瘤细胞合成、分泌外泌体改善曲妥珠单抗对肿瘤细胞的肿瘤效果［11］。磷脂酶D2(phospholipase D2,PLD2)是Syndecan-Syntenin-Alix外泌体合成途径的调节因子。Borel等［12］指出非特异性PLD2抑制剂Halopemide可通过抑制前列腺癌外泌体的分泌抑制前列腺癌的骨转移。胆固醇是肿瘤中外泌体分泌所必需的。Kulshreshtha等［13］研究发现辛伐他汀可通过降低胆固醇减少几种巨噬细胞和上皮细胞的外泌体分泌。目前关于他汀类药物通过调节外泌体分泌来发挥其抗癌特性的机制并未完全阐明。在另一项研究中,Lv等［14］使用黄连碱抑制肿瘤相关成纤维细胞分泌外泌体circCCT3,从而在体内和体外阻断肝细胞癌的进展。肿瘤外泌体生成与Ras/Raf/ERK信号通路密切相关。有报道指出,ERK抑制剂SCH772984通过阻断外泌体的分泌促进CD8+T细胞向肿瘤迁移,从而增强肿瘤免疫治疗的疗效［15］。研究已经证实携带肿瘤细胞来源的程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)的细胞外泌体与产生程序性死亡1(programmed death 1,PD-1)的T细胞通过相互作用可显著降低患者对免疫检查点阻断药物的反应。Lee等［16］发现macitentan通过抑制肿瘤细胞来源的外泌体PD-L1分泌,减少PD-1与外泌体PD-L1的结合,协同抗PD-L1抗体的作用,最终增强CD8+T细胞介导的肿瘤杀伤作用。目前也有研究试图通过抑制肿瘤相关外泌体的摄取以达到治疗肿瘤的目的。Zheng等［17］发现用内吞作用抑制剂治疗可以抑制骨髓基质细胞对多发性骨髓瘤细胞外泌体的摄取,从而抑制骨髓基质细胞中多种促增殖途径的变化。总的来说,这些研究表明抑制外泌体合成、分泌和摄取可以中断肿瘤细胞和基质细胞之间的通讯,这将为肿瘤治疗提供潜在的辅助策略。

在临床上,通过纳米技术将药物准确递送至肿瘤细胞是提高肿瘤治疗效果的最有希望的手段。与脂质体纳米材料、金属纳米材料和聚合物纳米材料相比,外泌体作为载体具有良好的生物利用度、低非靶向细胞毒性和免疫原性等优点。越来越多的研究证明,外泌体可以稳定转移药物(如治疗性化疗药物、miRNA、蛋白质等)并被受体细胞吸收。例如,Zhang等［18］开发了一种用超顺磁性氧化铁纳米颗粒修饰过的载有多柔比星的中性粒细胞外泌体,该外泌体在外部磁场下选择性地聚集在肿瘤部位,有效地抑制了肿瘤生长,并大大延长了小鼠的存活率。氧化石墨烯被壳寡糖和γ-聚谷氨酸共价修饰后形成GO-CO-γ-PGA载体。该载体具有良好的药物传递性能,但不具备主动靶向能力。Chen等［19］利用乳腺癌肿瘤细胞外泌体具有良好的靶向性的特点,将外泌体、GO-CO-γ-PGA、米托蒽醌合成一种全新的仿生纳米智能给药载体(EXO-GO-CO-γ-PGA-MIT),该载体显示出了良好的抗肿瘤能力。这些研究表明,肿瘤外泌体仿生纳米颗粒是一种很有前途的肿瘤治疗药物递送系统,在肿瘤治疗中具有潜在应用价值。在另一项研究中,Lin等［20］合成了一种新型靶向PD-L1外泌体,用于通过基因治疗肺癌的目的。结果表明,构建的装载siRNA的靶向外泌体纳米囊泡具有低毒性、高装载率的特点,可用于靶向肿瘤细胞基因治疗。MiR-124在治疗神经母细胞瘤中具有极大的潜力,但其对靶向肿瘤细胞的有效递送仍然存在巨大挑战。最近,Sharif等［21］通过人脂肪组织来源的间充质干细胞递送的外泌体成功将外源性MiR-124递送至神经母细胞瘤细胞,导致神经母细胞瘤细胞增殖减少并诱导其分化。这表明通过外泌体将外源性miRNA有效递送至靶向肿瘤细胞有望成为治疗肿瘤的新方法。肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor alpha,TNF-α)能够诱导肿瘤发生出血性坏死。然而,全身性应用TNF-α会导致严重的不良反应。最近,Zhuang等［22］通过转铁蛋白-转铁蛋白受体(transferrin-transferrin receptor,Tf-TfR)相互作用将转铁蛋白修饰的SPIONs(transferrin-modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles,Tf-SPIONs)结合到TNF-α-外泌体上,产生良好的水分散性TNF-α-外泌体-SPIONs。在小鼠黑色素瘤皮下癌模型中,TNF-α-外泌体-SPIONs可以增强靶向肿瘤的能力,抑制肿瘤生长,同时降低毒性。因此,TNF-α-外泌体-SPIONs在膜靶向治疗中显示出巨大的潜力。

外泌体对免疫系统具有免疫抑制和免疫刺激作用,因此外泌体作为载体可以启动抗肿瘤免疫反应,对肿瘤进展具有显著的抑制作用。在一项研究中,Nie等［23］合成了响应性外泌体纳米生物偶联物用于肿瘤治疗,其通过pH敏感的接头将源自M1巨噬细胞的叠氮化物修饰的外泌体与CD47和SIRPα(aCD47和aSIRPα)的二苯并环辛炔修饰抗体偶联。同时,纳米生物偶联物可以在全身给药后有效地将巨噬细胞从促肿瘤M2重编程为抗肿瘤M1。肿瘤疫苗是一种很有前途的癌症免疫疗法,其中纳米疫苗已成为一种新颖且有前景的抗癌策略。最近,Liu等［24］在小鼠皮下肺癌模型中开发了一种肿瘤疫苗,该疫苗将黑磷量子点与外泌体封装在一起。结果表明,疫苗接种联合光热疗法对肺癌有显著的治疗效果,并促进T淋巴细胞向肿瘤组织的浸润［24］。

3.3在肿瘤预后中的应用 最近的研究表明,各种类型的肿瘤所分泌的血清外泌体与肿瘤进展、肿瘤恶性程度和预后有关。Lan等［25］的一项研究发现,与健康对照组相比,胶质瘤患者的外泌体miR-210的表达水平升高,并且与总生存期独立相关。因此外泌体miR-210的血清水平可作为诊断、预后和缺氧生物标志物来反映胶质瘤状态和缺氧特征。此外,血清外泌体miR-210水平与肿瘤复发相关,并随着病理分级的升高而增加［25］。越来越多的证据表明,外泌体环状RNA在评估各种肿瘤预后方面发挥着重要作用。例如,Zhang等［26］发现环状RNA circTMEM45A水平在肝细胞癌中显著上调,与肝细胞癌患者的临床病理特征和预后不良呈正相关。此外,环状RNA circTMEM45A在肝细胞癌患者的血清外泌体中上调。另一项研究表明,外泌体环状RNA circAKT3的上调与肝细胞癌复发和病死率升高的风险相关［27］。此外,术后对具有高外泌体环状RNA circAKT3的肝细胞癌患者进行随访可能有助于降低复发风险并改善预后［27］。越来越多的证据表明,lncRNAs也具有作为诊断和预后生物标志物的潜力。Li等［28］发现linc00852在骨肉瘤组织中显著高表达。外泌体linc00852受AXL表达调控,也与AXL mRNA表达明显相关,被认为是一种新的肿瘤生物标志物和骨肉瘤的特殊治疗靶点［28］。在另一项研究中,Chen等发现膀胱癌细胞分泌外泌体长非编码RNA(lncRNA),称为淋巴结转移相关转录物2(lymph node metastasis-associated transcript 2,LNMAT2),在体外刺激人淋巴管内皮细胞迁移,并在体内增强肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移［29］。γ-谷氨酰转移酶在谷胱甘肽代谢中起关键作用。越来越多的研究表明,血清γ-谷氨酰转移酶升高与多种肿瘤的存活率呈负相关。最近,Horie等［30］发现在晚期肾细胞癌中,血清外泌体γ-谷氨酰转移酶表达升高。这可能是临床上判断肾细胞癌预后生物标志物。这些研究表明,外泌体有望成为肿瘤预后的生物标志物。

3.4在临床应用的挑战 一些临床试验提示外泌体在治疗各种人类疾病具有良好的疗效。Ye等［31］将间充质干细胞衍生的外泌体用于敏感皮肤的治疗,经治疗后患者包括粗糙、鳞屑、红斑在内的客观症状和包括紧张、灼热或瘙痒在内的主观症状得到明显缓解。该试验提示充质干细胞衍生的外泌体可改善敏感皮肤患者的临床症状和皮疹,有望作为一种无充质干细胞的治疗敏感皮肤相关疾病的新方法。在另一项研究中,Nazari等［32］将脐带中提取的间充质干细胞外泌体用于难治性瘘管患者的治疗,经治疗后患者,患者肛瘘得到改善,同时所有患者均未出现全身或局部不良反应。因此,外泌体在治疗各种人类疾病中具有重要价值。但是成功开发外泌体疗法目前也面临一些巨大障碍,这些障碍急需得到解决［33］。由于外泌体是细胞分泌的产物,细胞选择是在不改变外泌体组成和功能的情况下产生外泌体的关键第一步。因此,需要开发产量高、变异性小的细胞系。与此同时,目前也需开发成熟的生物反应器,使其在最佳无血清培养条件下能够制造临床级外泌体。其次,目前急需建立一个强大的外泌体纯化工艺以便获得高产量和高纯度的治疗外泌体。在外泌体治疗药物生产过程中,杂质如宿主细胞蛋白、DNA、细胞碎片、凋亡小体和微囊泡应被尽可能彻底地控制和去除。目前外泌体分析技术的局限性是大规模外泌体制造的最大障碍之一。因此,急需建立一套外泌体治疗产品的质量控制、分析方法。尽管如此,一些外泌体治疗产品通过克服这些制造技术难题已进入临床试验阶段。

4 结 语

总之,目前对肿瘤外泌体的研究尚处于起步阶段,外泌体在肿瘤中的病理生理作用及其机制仍有待进一步探索。外泌体含有多种蛋白质和核酸,其半衰期长。因此,外泌体有望成为肿瘤诊断的生物标志物,有望提高肿瘤的早期诊断率和肿瘤患者预后的评估。外泌体可以穿过细胞膜,不易引起免疫反应。作为药物载体,外泌体具有独特的优势,为基因、抗肿瘤药物等药物的转运开辟了一条新途径。目前,在外泌体工程技术和外泌体药物递送系统设计方面取得了一些进展。然而,如何实现高效载药、提高靶向性以及外泌体在肿瘤微环境中的作用机制仍需深入研究。同时需要注意的是,外泌体给药系统的临床转化研究与非临床研究存在一定的差异。随着医学技术、外泌体提取和检测技术的不断进步,以及对外泌体生物学功能及其在肿瘤发生发展中的机制和作用的深入研究,外泌体将为早期肿瘤筛查、精准诊断、个体化治疗以及未来抗肿瘤药物的开发提供新的思路和策略。