金丝桃苷对高脂饮食引起的肥胖伴胰岛素抵抗小鼠的保护作用

杨 雪,魏 叶,朱心瑶,谭 伟,王晓燕,张志勇,王志荣,刘治国*

0 引言

肥胖和糖尿病的主要原因是脂质和葡萄糖代谢功能障碍。目前,全球肥胖人数超过7亿人,约占全球人口的10%[1]。2021年全世界糖尿病患者共5.37亿,我国约1.4亿,是全球第一大糖尿病发病国家[2]。肥胖对机体胰岛素敏感性和葡萄糖稳态均有较大影响,越来越多的证据表明,肥胖会增加胰岛素抵抗和2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)等患病风险[3-4]。治疗胰岛素抵抗的药物较多,但均有一定的不良反应。因此,有必要去寻找能够减轻体重、改善胰岛素敏感性且安全性好的药物或膳食补充剂。黄酮类天然膳食化合物因其在预防肥胖和糖尿病方面的潜力而受到关注[5]。金丝桃苷(Hyperoside,Hyp)是一种天然的、植物来源的黄酮醇苷类化合物,具有多种药理学活性[6-8]。本研究采用高脂饮食喂养小鼠建立肥胖伴胰岛素抵抗的动物模型,模拟体内高血糖、高血脂及胰岛素抵抗状态等,并观察金丝桃苷对肥胖伴胰岛素抵抗小鼠代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 普通饲料(D12450B)和高脂饲料(D12492)(Research Diets,USA);金丝桃苷(上海陶素生化科技有限公司,批号:142234);羧甲基纤维素钠(CMC)(Sigma,USA);Merck Milliproe 液相芯片试剂盒(成都米利安生物科技有限公司);苏木精、伊红染液(碧云天生物技术研究所);FastQuant cDNA试剂盒与SYBR Green Master Mix(北京天根生化科技有限公司)。

1.2 动物试验 动物模型参照重庆医科大学肖晓秋教授课题组方法[9-11]。30只健康6周龄的雄性C57BL/6小鼠[济南朋悦试验动物繁育有限公司,许可证号:SCXK(鲁)2014-0007],适应性喂养1周后,随机分为对照组、高脂组、金丝桃苷组,每周固定时间称重。对照组给予普通饲料,高脂组及金丝桃苷组喂养高脂饲料,喂养14周后建模成功(n=10)。将金丝桃苷溶于0.5%CMC中制成混悬液,金丝桃苷组剂量为50 mg/(kg·d)进行灌胃,对照组和高脂组给予相应溶媒,灌胃时间为9周。动物实验结束前1 d,小鼠过夜禁食后,腹腔注射10%水合氯醛后脱颈处死,收集血清和肝脏等组织。

1.3 血清生化及细胞因子检测 取全血后静置30 min,1 000 g 4 ℃离心10 min,采血清,用全自动生化分析仪检测血糖、TC、TG、LDL、HDL等指标。使用Merck Milliplex液相芯片试剂盒检测脂联素和瘦素。

1.4 葡萄糖耐量实验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT) 采用GTT检测小鼠糖耐受能力。小鼠隔夜禁食8 h以上,取尾静脉血测血糖值为G0,然后腹腔注射葡萄糖(2 mg/kg),分别在注射后15、30、60、120 min检测血糖,计算曲线下面积(AUC)。实验结束前1周,行ITT。小鼠禁食4 h,测得初始血糖后,按照0.5 U/kg注射胰岛素,分别在注射后15、30、60、120 min时测量血糖,绘图并计算AUC。胰岛素抵抗稳态评估模型(HOMA-IR)=空腹血糖(mmol/L)×胰岛素(μU/ml)/22.5。

1.5 实时荧光定量PCR 按照Trizol试剂盒提取总RNA,用FastQuant cDNA试剂盒获得cDNA,用SYBR Green Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR),引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 HE染色 小鼠肝脏用4%的多聚甲醛固定后,再用石蜡包埋,切片后行苏木精-伊红染色(HE),在光学显微镜下拍照。

2 结果

2.1 动物模型 计算出各组小鼠的GTT曲线下面积和体重的平均值,并以对照组为基准,剔除高脂组和金丝桃苷组中低于平均值的小鼠。高脂组和金丝桃苷组小鼠GTT曲线下面积和体重均显著高于对照组,表明动物模型建立成功。建模成功后灌胃9周。

2.2 金丝桃苷对高脂小鼠体重的影响 第14周开始给药,给药前高脂组和金丝桃苷组小鼠体重明显高于对照组(P<0.05),高脂组和金丝桃苷组比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表2。给药1周后(第15周),金丝桃苷组小鼠体重略低于高脂组;给药3周后(第17周),金丝桃苷组和高脂组小鼠体重比较差异有统计学意义(P<0.05);给药9周后(第23周),对照组和高脂组及金丝桃苷组小鼠体重差异有统计学意义(P<0.05),且金丝桃苷组小鼠体重低于高脂组(P<0.05)。见表2。

表2 三组小鼠周体重比较(g)

2.3 金丝桃苷对小鼠血糖和胰岛素抵抗状态的影响 给药5～7周后(第19～21周),GTT结果显示,高脂组AUC高于对照组和金丝桃苷组(P<0.05),而对照组与金丝桃苷组比较差异无统计学意义(P>0.05),见图1A、1B。ITT结果显示,高脂组小鼠AUC高于对照组和金丝桃苷组(P<0.05),对照组与金丝桃苷组比较差异无统计学意义,与空腹血糖和GTT结果一致。见图1C、1D。给药9周后(第23周),高脂组小鼠的空腹血糖(FBG)和胰岛素抵抗(HOMA-IR)评分高于金丝桃苷组和对照组(P<0.05),而对照组与金丝桃苷组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1E、21F。

图1 金丝桃苷对小鼠血糖和胰岛素抵抗状态的影响注:A:葡萄糖耐量试验(GTT);B:GTT曲线下面积;C:胰岛素耐量试验(ITT);D:ITT曲线下面积;E:空腹血糖;F:胰岛素抵抗稳态评估模型(HOMA-IR)评分。*P<0.05

2.4 金丝桃苷对肝脏脂质的影响 高脂组和金丝桃苷组小鼠的TC、TG、LDL、HDL均高于对照组(P<0.05),高脂组高于金丝桃苷组 (P<0.05)。见表3。分别取三组小鼠的肝脏进行HE染色,由图2可见,高脂组和金丝桃苷组小鼠肝脏内脂质沉积多于对照组,而金丝桃苷组少于高脂组。

图2 三组小鼠肝脏脂质沉积比较

表3 三组小鼠血脂指标比较(mmol/L)

2.5 金丝桃苷对脂联素和瘦素分泌的影响 金丝桃苷组小鼠分泌的脂联素高于对照组和高脂组(P<0.05),而高脂组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);金丝桃苷组和高脂组小鼠的瘦素高于对照组(P<0.05),金丝桃苷组高于高脂组 (P<0.05)。见表4。

表4 三组小鼠脂联素和瘦素含量比较

2.6 金丝桃苷差异化调节肝脏内糖脂代谢相关基因 与对照组相比,高脂组小鼠肝脏内固醇调节元件结合蛋白(SREBP1c)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)基因均明显升高(P<0.05),而金丝桃苷组均低于对照组和高脂组(P<0.05)。高脂组腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)表达低于对照组(P<0.05),而金丝桃苷组AMPK基因表达高于其他组(P<0.05)。见图3。

图3 金丝桃苷差异化调节小鼠肝脏内基因表达注:*P<0.05

3 讨论

胰岛素抵抗是肥胖和2型糖尿病的共同特征,且肥胖的2型糖尿病患者胰岛素抵抗更明显[12]。研究表明,肝脏脂质沉积与胰岛素抵抗和葡萄糖代谢障碍密切相关[13],血脂异常的2型糖尿病患者发生血管相关并发症的风险会进一步增加[14]。近年研究表明,天然产物可用于预防或治疗代谢综合征,如肥胖、2型糖尿病、血脂异常等,且安全性好[15-16]。因此,从天然产物中寻找药物先导化合物或膳食补充剂来预防和治疗代谢性疾病已成为目前的研究热点。

金丝桃苷是一种天然的黄酮醇苷类化合物,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种活性。本研究显示,高脂组小鼠体重、血糖、血脂等均明显高于对照组,而给予金丝桃苷干预后,小鼠体重和空腹血糖明显降低;此外,金丝桃苷可明显降低高脂小鼠TC、TG、LDL、HDL水平;HE染色显示,金丝桃苷能够减轻肝脏内脂质沉积。结果表明,金丝桃苷能够改善高脂饮食小鼠糖脂代谢紊乱状态。

瘦素和脂联素都是脂肪细胞分泌的脂肪因子。瘦素能够提高胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗,可通过激活AMPK来改善血脂异常[17-19]。研究表明,脂联素是一种胰岛素增敏剂,能够促进机体对葡萄糖的利用,增加机体对胰岛素的敏感性[20-21]。脂联素可增加AMPK 的磷酸化和活化,从而促进脂肪氧化和葡萄糖转运[22]。本研究显示,金丝桃苷能够降低高脂组小鼠的血糖,显著降低小鼠HOMA-IR评分,且与GTT和ITT一致。进一步研究发现,金丝桃苷能够显著增加脂联素和瘦素的分泌,表明金丝桃苷可能是通过增加脂联素和瘦素的分泌,增加葡萄糖的利用,降低血糖,改善高脂组小鼠胰岛素抵抗,增强小鼠糖耐受能力。

AMPK是治疗代谢性疾病的主要靶点[23]。AMPK低表达可减少脂肪酸的氧化,导致脂肪合成增加[24],而肝脏AMPK高表达可降低脂肪生成和肝脏TG含量,同时增加脂肪酸氧化相关基因的表达并促进脂肪酸的β-氧化[25]。结果显示,金丝桃苷可促进高脂饮食小鼠AMPK的表达。SREBP1c是控制脂肪开始合成的最重要的转录调节因子之一[26]。酰基辅酶A羧化酶(ACC)是催化脂肪酸合成的第一个限速步骤,而脂肪酸合成酶(FAS)是负责脂肪酸从头合成的酶,SREBP1c主要通过激活ACC和FAS来调节脂肪生成过程。研究表明,金丝桃苷能够降低高脂饮食小鼠的TC、LDL、HDL。进一步研究显示,金丝桃苷可抑制小鼠肝脏内SREBP1c、ACC、FAS的基因表达,表明金丝桃苷可通过减少SREBP1c、ACC和FAS的表达,抑制肝脏内的脂质合成。

综上所述,金丝桃苷通过调节AMPK和脂质代谢相关基因,从而改善高脂饮食引起的肥胖小鼠的胰岛素抵抗状态和肝脏脂质积累,表明金丝桃苷可能是治疗2型糖尿病的潜在药物或膳食补充剂。