芍药苷对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响机制

张 艺,张 继,叶彩云,王瑞华,党 璇

0 引言

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种以慢性无排卵、高雄激素血症为特征的内分泌异常的疾病,患者临床表现为多毛、经期不规律、不孕[1-2]。患者卵巢增大、白膜增厚,并伴有颗粒细胞黄素化。颗粒细胞是雌激素、孕激素的主要来源,是组成卵泡的最大细胞群,支撑卵母细胞,在PCOS中发挥重要作用[3]。暴露于雄激素下的颗粒细胞可导致卵泡发育停滞[4]。在小鼠PCOS模型中,颗粒细胞增殖受限,大量凋亡,无法为卵泡提供营养[5]。因此促进颗粒细胞的存活增殖是恢复PCOS模型卵泡正常发育的方式之一。研究显示,芍药苷在大鼠体内可减轻脱氢表雄酮(DHEA)诱导的PCOS大鼠卵巢纤维化[6]。芍药苷能否影响PCOS大鼠颗粒细胞仍有待研究。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物1-α(PGC-1α)为线粒体生物发生的主要调节因子,PGC-1α在卵巢颗粒细胞中表达降低与卵巢颗粒细胞损伤有关,可能是PCOS发生发展的重要原因[7]。PGC-1α由线粒体能量代谢相关调节因子控制,如单磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和沉默信息调节因子1(SIRT1),AMPK和SIRT1分别通过磷酸化和脱乙酰化直接影响PGC-1α活性[8]。研究显示,AMPK/SIRT1信号通路在PCOS小鼠卵巢颗粒细胞中被抑制,与卵巢中的颗粒细胞数量减少有关,且可能是PCOS中胰岛素抵抗的分子机制,可作为开发改善PCOS代谢和生殖功能的治疗靶点[9]。因此,调控AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路可被视为对抗PCOS的潜在药物靶点。

1 材料与方法

1.1 动物与主要试剂 SPF级SD雌性大鼠10只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2022-0063。芍药苷、脱氢表雄酮(DHEA)购自上海源叶生物科技有限公司;Compound C(AMPK抑制剂)、EX527(SIRT1抑制剂)购自MCE公司。

1.2 方法

1.2.1 PCOS模型建立 10只大鼠模型建立前适应性喂养7 d,按照随机数字表法选取5只作为对照组,剩余大鼠皮下注射DHEA(6 mg/100 g),连续注射21 d,从第16天开始连续4 d观察大鼠阴道涂片,连续出现角质细胞为造模成功[10]。对照组以等量豆油代替。

1.2.2 卵巢颗粒细胞的分离与鉴定 冲洗大鼠卵巢组织(生理盐水),去除脂肪与输卵管等组织,DMEM/F12培养基内培养,穿刺窦卵泡使颗粒细胞释放于培养基内,过滤纯化,将颗粒细胞重悬、过滤。在37 ℃、5% CO2培养箱内培养,细胞贴壁后,去除未贴壁细胞,每2天更换培养基,镜下观察细胞形态。免疫细胞化学法鉴定颗粒细胞:制备细胞爬片,洗涤、固定,过氧化氢孵育、封闭,加入兔抗鼠促卵泡激素受体(FSHR)(1∶200)(颗粒细胞标志物),孵育过夜,清洗,加入相应二抗(1∶2 000),荧光显微镜拍照。

1.2.3 细胞分组 取培养对数生长期颗粒细胞,正常大鼠颗粒细胞作为对照组,将模型大鼠颗粒细胞分为PCOS组、芍药苷低浓度组、芍药苷高浓度组[6]、芍药苷高浓度+Compound C组[11]、芍药苷高浓度+EX527组[12],芍药苷低、高浓度组分别添加200 μg/ml、800 μg/ml芍药苷,芍药苷高浓度+Compound C组在800 μg/ml芍药苷基础上添加20 μmol/L的Compound C,芍药苷高浓度+EX527组在800 μg/ml芍药苷基础上添加100 μmol/L EX527,培养细胞。

1.2.4 卵巢颗粒细胞雌二醇(E2)和孕酮(P)含量 收集“1.2.3”中各组颗粒细胞,接种到24孔板,每孔105个细胞,在培养箱内培养24 h后收集细胞培养液,终止前3 h 加入100 ng/ml FSH,放射免疫法测定E2与P含量。

1.2.5 CCK8法测定颗粒细胞活性 收集“1.2.3”中各组颗粒细胞,按照5 000/孔细胞数量接种至96孔,48 h后添加CCK-8试剂孵育,4 h后酶标仪测定450 nm处光密度(OD450)。

1.2.6 克隆形成试验 收集“1.2.3”中各组颗粒细胞,接种至6孔板中(200个/孔),2周后观察克隆形成,弃上清,加入甲醇固定15 min,加入Giemsa染色液,为紫色,拍照并计数。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 按照“1.2.3”中分组方法将颗粒细胞接种于6孔板(5×105/孔),每组设置6个复孔,加入Annexin V-FITC和PI 染料,避光孵育20 min,流式细胞仪检测。

1.2.8 Western blot法测定细胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达 提取细胞总蛋白并定量,SDS-PAGE电泳后,将部分蛋白转至PVDF膜,封闭(5%脱脂奶粉),添加兔抗p-AMPK(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、SIRT1(1∶1 000)、PGC-1α(1∶1 000)、GAPDH(作为内参,稀释比1∶5 000),孵育过夜,添加二抗,孵育1 h,ECL试剂进行显色后经凝胶成像仪曝光、观察,Image-J软件分析蛋白含量,每组设置3个重复。

2 结果

2.1 颗粒细胞的鉴定 对照组大鼠卵巢颗粒细胞呈多边形或梭形,细胞间由伪足连接在一起(图1A);PCOS组大鼠卵巢颗粒细胞呈多形性或纤维状(图1B);免疫细胞化学法检测结果显示,对照组与PCOS组大鼠颗粒细胞FSHR均呈阳性表达(图1C-D)。

图1 颗粒细胞形态以及免疫荧光图注:A.培养3 d的对照组大鼠卵巢颗粒细胞形态;B.培养3 d的PCOS组大鼠卵巢颗粒细胞形态;C.免疫细胞化学法检测对照组大鼠卵巢颗粒细胞FSHR阳性表达;D.免疫细胞化学法检测PCOS组大鼠卵巢颗粒细胞FSHR阳性表达

2.2 各组卵巢颗粒细胞雌激素、孕激素分泌情况 与对照组相比,PCOS组卵巢颗粒细胞E2、P水平降低(P<0.05);与PCOS组相比,芍药苷低浓度组及芍药苷高浓度组卵巢颗粒细胞的E2、P水平升高(P<0.05);与芍药苷高浓度组相比,芍药苷高浓度+Compound C组、芍药苷高浓度+EX527组卵巢颗粒细胞的E2、P水平降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组卵巢颗粒细胞E2、P水平测定

2.3 各组卵巢颗粒细胞活性情况 与对照组相比,PCOS组颗粒细胞OD450值降低(P<0.05);与PCOS组相比,芍药苷低浓度组、芍药苷高浓度组颗粒细胞OD450值升高(P<0.05);与芍药苷高浓度组相比,芍药苷高浓度+Compound C组、芍药苷高浓度+EX527组颗粒细胞OD450值降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组颗粒细胞OD450值情况

2.4 各组卵巢颗粒细胞克隆形成数情况 与对照组相比,PCOS组颗粒细胞克隆形成数降低(P<0.05);与PCOS组相比,芍药苷低浓度组、芍药苷高浓度组颗粒细胞克隆形成数升高(P<0.05);与芍药苷高浓度组相比,芍药苷高浓度+Compound C组、芍药苷高浓度+EX527组颗粒细胞克隆形成数降低(P<0.05)。见表3、图2。

表3 各组颗粒细胞克隆形成数比较

图2 各组卵巢颗粒细胞克隆形成图注:PCOS:多囊卵巢综合征;Compound C:AMPK抑制剂;EX527:SIRT1抑制剂

2.5 各组卵巢颗粒细胞凋亡情况 与对照组相比,PCOS组颗粒细胞凋亡率升高(P<0.05);与PCOS组相比,芍药苷低浓度组、芍药苷高浓度组颗粒细胞凋亡率降低(P<0.05);与芍药苷高浓度组相比,芍药苷高浓度+Compound C组、芍药苷高浓度+EX527组颗粒细胞凋亡率升高(P<0.05),见表4、图3。

表4 各组颗粒细胞凋亡情况

图3 各组颗粒细胞凋亡情况注:PCOS:多囊卵巢综合征;Compound C:AMPK抑制剂;EX527:SIRT1抑制剂

2.6 各组卵巢颗粒细胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达的比较 与对照组相比,PCOS组卵巢颗粒细胞p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α水平降低(P<0.05);与PCOS组相比,芍药苷低浓度组、芍药苷高浓度组卵巢颗粒细胞p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α水平升高(P<0.05);与芍药苷高浓度组相比,芍药苷高浓度+Compound C组、芍药苷高浓度+EX527组卵巢颗粒细胞p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α水平降低(P<0.05),见表5、图4。

表5 各组卵巢颗粒细胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达情况

图4 各组卵巢颗粒细胞AMPK/SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达注:A.对照组;B.PCOS组;C.芍药苷低浓度组;D.芍药苷高浓度组;E.芍药苷高浓度+Compound C组;F.芍药苷高浓度+EX527组

3 讨论

PCOS是育龄期女性常见的内分泌失调疾病,患者表现为月经不调、不孕、痤疮、多毛,影响女性生殖健康。颗粒细胞是构成卵泡的细胞群,为卵母细胞提供营养,是后续雌激素、孕激素的关键来源,对胚胎植入子宫内膜提供支持,其丰富程度与卵子质量密切相关[13-14]。在高雄激素刺激下,颗粒细胞数量不足,卵泡发育不良,也是患者不孕的重要原因。因此,去除刺激并恢复颗粒细胞的正常增殖是PCOS疾病治疗的方式之一。

芍药苷是来源于芍药科植物的活性物质,具有抗癌、抗自由基损伤、抑制细胞内钙超载和抗神经毒性、免疫调节等活性,且芍药苷毒性很低,对大鼠心、肝、脾、肺等多种脏器无明显毒副作用。芍药甘草汤是PCOS的治疗名方,程瑶[15]研究显示,在PCOS疾病状态下,大鼠代谢异常,芍药苷草汤的主要成分-芍药苷的生物利用度显著下降。于春玲等[16]研究显示,芍药苷可调整经期前综合征大鼠血清雌激素水平以及大脑皮层雌激素受体表达。以上研究均表明,芍药苷可能在PCOS大鼠颗粒细胞的发育过程中发挥作用。本研究中,经芍药苷处理大鼠,血清E2、P水平升高,提示芍药苷对促进PCOS大鼠的激素分泌有效。将大鼠颗粒细胞分离并培养,经鉴定,PCOS模型大鼠卵巢颗粒细胞FSHR阳性率升高,FSHR是颗粒细胞的特异性标志物,提示制备的颗粒细胞具备正常形态。给予不同浓度芍药苷处理,发现颗粒细胞的活性增加,凋亡率下降,且在两个浓度中细胞活性与凋亡率存在差异。细胞增殖升高与凋亡的降低也充分证明了芍药苷对卵巢颗粒细胞的作用。但芍药苷发挥促卵巢颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡的作用机制仍有待进一步分析。

AMPK是一种细胞代谢传感器,在保护细胞功能方面起着至关重要的作用。研究显示,PCOS大鼠不孕可能与AMPK通路受阻导致的线粒体损伤有关[17]。邓煜等[18]研究显示,白藜芦醇可通过激活AMPK通路抑制多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞自噬。以上研究表明,AMPK可在PCOS中发挥作用。SIRT1可参与DNA修复、细胞存活等细胞过程,其在卵母细胞的发育以及衰老中发挥作用[19]。PGC-1α是一种多功能转录辅激活因子,可参与调解线粒体生物发生的多种核受体和转录因子的活性,在高能量需求的组织中高表达,调控能量代谢,与雌激素受体相结合,参与卵巢癌的调控[20]。金小琴等[21]研究显示,PGC-1α对大鼠卵巢颗粒细胞代谢有影响。

本研究中,PCOS大鼠卵巢颗粒细胞AMPK受抑制,与正常大鼠卵巢颗粒细胞比较,p-AMPK/AMPK值降低,SIRT1、PGC-1α蛋白表达降低,提示AMPK/SIRT1/PGC-1α通路可能在卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡中发挥作用。为探究芍药苷能否通过调整此通路影响颗粒细胞的增殖与凋亡,本研究还检测了芍药苷处理后的颗粒细胞,发现p-AMPK/AMPK值升高,SIRT1、PGC-1α蛋白表达升高,提示芍药苷可能通过调控AMPK/SIRT1/PGC-1α通路发挥作用,为验证此猜想,在芍药苷高浓度基础上分别添加AMPK抑制剂(Compound C)、SIRT1抑制剂(EX527),发现芍药苷对颗粒细胞的作用均被逆转,此结果验证了本研究开始的猜想。

综上所述,芍药苷可能通过调控AMPK/SIRT1/PGC-1α通路促进PCOS卵巢颗粒细胞增殖,并抑制细胞凋亡。