基于AMPK-ACC信号通路探究miR-543对肺癌细胞放疗敏感性的机制研究

储祥健, 曹海燕, 戴美云

(江苏省如皋市人民医院, 江苏 如皋 226500)

肺癌是目前第二常见的癌症,也是癌症死亡的主要原因(占癌症死亡总数的18.0%),2020年预计约有220万例肺癌新发病例,180万人因该疾病去世[1]。非小细胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma ,NSCLC)约占所有肺癌的80～85%,主要分为腺癌(LUAD,约40～50%的病例)和鳞癌(SqCC,约20～30%的病例)[2,3]。肺腺癌作为肺癌的主要亚型,约占所有肺癌患者的40%,尽管在早期诊断和治疗方面取得了重大进展,但肺腺癌患者的5年相对生存率仍低于15%[4]。目前,放射治疗是用于治疗NSCLC的重要方式,它能够提高肿瘤患者的生存率,但长期接受放射治疗会使患者产生抗性,导致治疗效果不理想[5]。因此,进一步了解影响NSCLC放疗抗性的分子机制,开发新的NSCLC放射增敏靶点,对提高患者的治疗效果至关重要。miRNAs在癌症的多种生物和病理过程中发挥着重要的调节作用[6]。越来越多的证据表明,miRNA会影响各种类型恶性肿瘤的放射治疗抗性。例如,在胃癌中,miR-612与TRPM2-AS结合,以增加FOXM1的表达,增强胃癌的进展放射治疗抵抗[7]。miR-219a-5p通过靶向CD164增强NSCLC细胞的放射敏感性。此外,miR-543被报道是肿瘤进展中的关键调控分子。miR-543被发现在乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌[8,9]中作为抑癌因子。Yu Q等证实miR-543通过靶向TWIST1抑制卵巢癌细胞的增殖和侵袭[10]。由于肿瘤存在异质性,miR-543也被发现在肺癌、胃癌[11]中发挥促癌基因的作用。如LncRNA-LINC01089通过海绵化miR-543抑制肺腺癌细胞增殖并促进细胞凋亡。综上,表明miR-543与肿瘤进展之间存在密切关系。然而,尚未有关于miR-543调控NSCLC放疗抗性性的研究报道。揭示了miR-543的表达与肿瘤放疗抵抗有关,进一步的细胞实验发现沉默miR-543可以诱导G0/G1阻滞并增强NSCLC的放疗敏感性。为miR-543p作为一种有前途的放疗致敏靶点提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1生信分析:肺腺癌miRNA表达量数据(Normal:20,Tumor:512)从TCGA数据库下载得到。‘edgeR’包用于差异分析(|logFC|>2,FDR<0.05),通过文献引证确定研究的目标miRNA。

1.2细胞培养和细胞转染:人NSCLC细胞A549、PC-9、H1299,人正常肺上皮细胞BEAS-2B均购自于北纳生物。在RPMI 1640培养基(Thermo Fisher Scientific,USA)中添加10%胎牛血清用于培养上述所有细胞。细胞培养环境为37℃,5%CO2。miR-543 inhibitor、 inhibitor-NC均购自于GenePharma(China)。在转染前24h内,将处于对数生长期的A549细胞和PC-9细胞重新贴壁在完全培养基中过夜培养。随后用新鲜的无血清培养基替换原始培养基。按照Liposome 2000(Life Technologies,USA)的指导方案进行转染。AMPK/ACC通路抑制剂A-769662(compound C; 20μM)购自Selleck(China)。

1.3qRT-PCR:用于RNA提取和PCR分析的方法按照前人描述的方法进行[12],使用U6 snRNA作为内参对细胞中的miRNA进行定量。qPCR检验使用StepOnePlus Real-Time PCR system (AB,USA)进行。qPR-PCR检测的结果使用2-ΔΔCt法进行相对定量。PCR使用的引物序列见表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.4CCK-8:将细胞以5×103个细胞/孔接种于96孔板中。将细胞过夜孵育后,根据不同实验需要处理细胞,然后到规定时间(处理结束的第0、1、2、3、4d后)按照CCK8试剂盒(China)制造商的说明进行操作,加入10μLCCK8试剂,然后在37℃培养箱中孵育30min,在450nm波长下测量吸光度。将不同剂量电离辐射(0Gy、2Gy、4Gy、8Gy、16Gy)处理后的肺腺癌细胞(5×103个细胞/孔)接种到96孔板中,在37℃培养箱中培养24h后,,在每个孔中加入10μL CCK8试剂,随后将96孔板放置于37℃培养箱中孵育30min,室温振荡30s,使用酶标仪在450nm波长下测量各孔的吸光度。

1.5集落形成实验:细胞经胰蛋白酶消化后,在6孔培养板各孔中接种1000个细胞。当培养皿中集落肉眼可见时,将细胞用4%多聚甲醛固定30min,并用0.2%结晶紫(Beyotime,China)染色以进行可视化和计数。

1.6蛋白质免疫印迹:实验重复三次。本文所用的一抗:兔抗AMPK/p-AMPK,ACC/p-ACC,β-actin;二抗:羊抗兔IgG (ab205718)均购自Abcam(British)。

1.7流式细胞术:细胞在6孔板中培养一周后用胰蛋白酶分离细胞,随后加以新鲜培养基中和。混合物在1200r/min的条件下离心10min。离心下来的细胞用PBS洗涤两次,重新悬浮于PBS(1mL)中,并在4℃下用9mL的70%乙醇固定24h。离心后,将每个细胞样品重新悬浮在染色液中。染色液包括RNAse(2μL,Thermo Fisher Scientific,USA)、PI(20μL,Thermo Fisher Scientific,USA)、吐温20(0.5μL)和PBS(477.5μL)。孵育30min后,通过流式细胞仪(Becton Dickinson,USA)对细胞进行分析。用不含EDTA的胰酶消化细胞后,300g,4℃离心5min收集细胞。计数5×105细胞,用预冷PBS洗涤细胞两次,每次300g,4℃离心5min。吸弃PBS,加入100μL 1×Binding Buffer重悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC和10μLPI Staining Solution,轻轻混匀,避光室温反应10-15min。加入400μL 1×Binding Buffer,混匀后放置于冰上,样品在1h内用流式细胞仪检测。

1.8射线处理:将细胞胞暴露于一定剂量的辐射(0Gy、2Gy、4Gy、8Gy、16Gy)下,使用直线加速器(Varian 2300EX,剂量率为2Gy/min;Varian,中国)。射线处理24h后,按照实际需要进行后续实验。

1.9数据统计:实验数据表示为平均值±标准差。本研究使用GraphPad Prism8.0软件(La Jolla,USA)进行统计分析。两组比较采用Student’s t检验,两组以上的差异采用单因素方差分析。本实验所有数据均通过三次独立实验的多重复孔/视野计算所得。P值<0.05被认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1miR-543在NSCLC中高表达:通过生信分析发现,在肺腺癌的肿瘤组织中miR-543的表达显著上调(图1A)。生存分析结果显示,miR-543高表达的患者生存质量较差(图1B)。最后,在体外细胞模型中,进一步验证,结果表明miR-543在NSCLC细胞系的表达显著高于正常肺上皮细胞(图1C)。其中在PC-9和A549细胞中表达相对较高,因此选择这两株细胞系用于后续的实验检测。综上,表明miR-543在NSCLC中高表达。

图1 miR-543在NSCLC中高表达

2.2沉默miR-543可以抑制NSCLC细胞的恶性表型:为探究miR-543对NSCLC细胞生物学功能的影响,将miR-543 inhibitor转染到不同的NSCLC细胞中,下调内源性miR-543的表达。qRT-PCR结果显示,转染miR-543 inhibitor的细胞miR-543表达水平显著降低(图2 A)。接着,CCK和集落形成实验结果显示,相较于对照组,miR-543 inhibitor显著抑制了PC-9和A549细胞活力(图2 B)和集落形成能力(图2 C)。流式细胞术检测结果显示,沉默miR-543使G0/G1期细胞数量显著升高,S期细胞数量显著降低(图2D),细胞凋亡率与对照组相比显著升高(图2 E)。综上表明,miR-543在NSCLC中发挥促进癌症恶性进展的作用。

图2 沉默miR-543可以抑制NSCLC细胞的恶性表型

2.3miR-543通过AMPK/ACC信号通路影响NSCLC细胞增殖、细胞周期进程和细胞凋亡:此前已有诸多研究报道AMPK/ACC信号通路在肿瘤增殖和凋亡中发挥重要调节作用[13]。因此,我们猜测miR-543可能通过AMPK/ACC信号通路影响NSCLC恶性进展。首先,我们研究了miR-543沉默表达后对AMPK/ACC信号通路的影响。结果显示miR-543表达的降低明显增强了NSCLC细胞中p-AMPK和p-ACC的表达,说明沉默miR-543促进了AMPK/ACC信号通路的活化(图3A)。我们使用AMPK/ACC信号通路抑制剂compound C进行验证,基于PC-9细胞构建了以下细胞分组:inhibitor-NC+DMSO、miR-543 inhibitor+DMSO、miR-543 inhibitor+ compound C。CCK-8和集落形成实验结果显示miR-543 inhibitor显著抑制了PC-9细胞活力和克隆形成能力;而进一步添加compound C处理可以减弱这种抑制作用(图3B-C)。细胞周期和凋亡检测结果显示,沉默miR-543使 PC-9细胞中G0/G1期细胞数量显著升高,S期细胞数量显著降低,细胞凋亡率与对照组相比显著升高;但进一步添加compound C处理可以逆转miR-543 沉默表达对细胞周期进程和细胞凋亡的影响(图3D-E)。综上,这些结果表明miR-543通过阻断AMPK/ACC信号通路促进NSCLC恶性进展。

图3 miR-543通过AMPK/ACC信号通路影响NSCLC增殖、细胞周期进程和细胞凋亡

2.4miR-543通过AMPK/ACC信号通路增强NSCLC放疗抗性:放射治疗是用于治疗NSCLC的重要方式,合理使用放疗可以使肺癌患者的五年局部控制率增加8.3%,存活率增加4%[5],但长期放疗容易使NSCLC患者产生抗性。我们先前的研究发现miR-543是NSCLC进展的促进因子,我们进一步通过实验来验证miR-543是否在NSCLC放疗敏感性调节中发挥潜在作用。我们通过PC-9细胞系构建了以下细胞分组:inhibitor-NC+DMSO、miR-543 inhibitor+DMSO、miR-543 inhibitor+ compound C。对每组细胞分别使用不同剂量辐射处理后。CCK8实验结果显示细胞的存活率均随着辐射强度的增大而降低,其中miR-543 沉默表达使细胞活力显著降低,在miR-543 沉默表达的同时添加compound C使得细胞活力恢复至接近正常水平,IC50统计结果与之相对应(图4 A)。克隆形成实验表明,miR-543 沉默表达后细胞集落的显著减少,对辐射抵抗能力下降,而进一步添加compound C可以逆转这一结果(图4 B)。这说明miR-543通过激活AMPK/ACC信号通路促进NSCLC细胞对产生放疗抗性。

图4 miR-543通过AMPK/ACC信号通路增强NSCLC放疗抗性

3 讨 论

放射抗性最近成为NSCLC治疗的一个关键障碍[14]。迄今为止,许多研究提出了miRNA在NSCLC放射抗性发生中的作用。例如,新鱼腥草素钠介导的MiR-147a通过抑制STAT3增强NSCLC细胞的放射敏感性[15]。Yue Yuan等[16]证实miR-410通过激活PI3K/mTOR通路诱导NSCLC细胞上皮间质转化和放射抗性。此外,据报道,miR-125a-5p通过靶向SIRT7促进细胞凋亡以增加NSCLC细胞的放射敏感性[17]。因此,在NSCLC的抗辐射过程中识别更多的miRNA具有重要价值。

目前,某些研究表明miR-543在某些类型的癌症中具有促癌作用。据报道,MiR-543通过Numb/p53调控轴促进前列腺癌症细胞的增殖、转移和干细胞特性[18]。Zhai F等揭示miR-543通过靶向KLF4促进结直肠癌增殖和转移[19]。此外,miR-543在肺癌中促癌作用也已被证实。在本研究中,我们的结果进一步证实了先前的报道,表明miR-543沉默表达抑制了NSCLC细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。这些结果提示miR-543可能在促进NSCLC进展中发挥作用。

放射抵抗是一种复杂的细胞反应,涉及许多信号通路和基因。异常活化的多种癌症相关信号通路能够参与影响癌症放射治疗的效果。Yulan Zeng等发现CDK5 通过 TAZ 激活 Hippo 信号通路促进肺癌细胞的放疗抗性[20]。Shi Z等报道Let-7a 靶向 Rsf-1 通过 Ras-MAPK 通路增强NSCLC细胞的放疗敏感性[21]。Xiong L等证实SIRT6通过PI3K/Akt/mTOR信号通路增强NSCLC细胞的放疗敏感性,抑制肿瘤进展[22]。本研究通过不同手段检测辐射对细胞增殖能力的影响情况,发现miR-543通过抑制AMPK/ACC信号通路增强NSCLC放疗抗性。

先前研究报道,AMPK是细胞能量感知和代谢平衡恢复的关键调节器[23]。而ACC是AMPK的底物,为脂肪酸的生物合成提供丙二酰CoA底物,该底物通过磷酸化被关闭,并通过去磷酸化被激活。关于AMPK/ACC信号通路在肿瘤进展中的作用已被诸多报道,如CPI-613通过AMPK-ACC信号重建脂质代谢以增强胰腺癌症细胞凋亡[13]。Kun Li等证实TRPP2表达的沉默通过抑制PERK/eIF2α信号通路增加了头颈癌细胞的增殖,而AMPK/ACC信号通路可能被反馈机制激活,以减少增强的细胞增殖。在本研究中,我们的结果显示miR-543通过抑制AMPK/AC信号通路的活化促进NSCLC细胞增殖,并诱导细胞凋亡,这与先前的研究结果相一致。此外,已有不少研究证实激活的AMPK信号通路可以提高肿瘤细胞对放疗的敏感性。如AICAR 激活 AMPK 可使前列腺癌细胞对放疗敏感。在胰腺癌中,儿茶酚通过诱导 AMPK的磷酸化,同时降低 Hippo 信号通路成分的表达,增强胰腺癌细胞对吉西他滨的化疗敏感性和放射敏感性。总之,本研究的观察结果足以初步证明AMPK-ACC信号在NSCLC治疗中的作用和重要性。

总之,本结果证实,miR-543在NSCLC细胞恶性进展和放疗抗性的作用。此外,我们的研究首次揭示了miR-543可以通过AMPK/ACC信号通路增强NSCLC细胞放疗抗性。但miR-543增强NSCLC放疗抗性的机制是在细胞水平上分析的,尚未在体内得到验证在动物层面。同时,也缺乏对下游靶基因的探索,这也是本研究的不足之处。我们将在未来进一步挖掘miR-543调控NSCLC进展及抗性的相关分子作用机制。总之,本课题发现为NSCLC的放疗抵抗机制提供了新的见解,并为miR-543作为有希望的放疗增敏靶点提供了理论基础。