结核分枝杆菌基因编码RD1-RD3抗原胶体金法检测对辅助诊断菌阴肺结核的价值

高德杰，孙义军，李晓霞，马 强

（滨州市结核病防治院1.结核科2.检验科，山东 滨州 251700）

2010 年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示，我国结核病年发病例数约为100 万，15 岁及以上人群活动性肺结核的患病率为459/10 万，菌阴肺结核占活动性肺结核的73.5%[1]，结核病的防控形势依然严峻。结核病实验室诊断一直依赖传统抗酸杆菌涂片镜检和培养技术，但涂片镜检的敏感度较差（与获得痰标本的质量因素密切相关），而培养所需时间较长，不能满足快速诊断的临床需要。本研究采用结核分枝杆菌基因编码RD1-RD3 抗原胶体金法（RD1-RD3 胶体金法）检测87 例菌阴肺结核患者的晨痰和肺泡灌洗液，观察其阳性检出情况，以评价RD1-RD3 胶体金法检测在诊断菌阴肺结核中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2011 年6 月至2022 年6 月在滨州市结核病防治院确诊并住院的菌阴肺结核患者87 例为试验组；其中男性51 例，女性36 例；年龄17 ～64 岁，平均（49.34±8.67）岁。另选取非结核病患者61 例（肺癌23 例、肺炎18 例、支气管扩张8 例、肺脓肿6 例和支气管哮喘6 例）为对照组；其中男性39 例，女性22 例；年龄18 ～71 岁，平均（48.76±7.93）岁。两组病例的性别和年龄相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 菌阴肺结核的诊断标准

菌阴肺结核为3 次痰涂片及1 次培养均阴性的肺结核，其具体诊断标准如下：（1）存在典型肺结核临床症状和胸部X 线表现。（2）抗结核治疗有效。（3）临床可排除其他非结核性肺部疾病。（4）PPD（5U）强阳性，血清抗结核抗体阳性。（5）痰结核菌PCR和探针检测呈阳性。（6）肺外组织病理证实结核病变。（7）肺泡灌洗液检出抗酸杆菌。（8）支气管或肺部组织病理证实结核病变。符合（1）～（6）项中的3 项或（7）、（8）项中的任何1 项可确诊[2]。

1.3 标本采集

对照组61 例患者和试验组87 例患者均留取晨痰1 份；同时试验组由临床医师行电子支气管镜肺泡灌洗术，留取肺泡灌洗液至少5 mL 送检。

1.4 检测方法

对照组和试验组患者的晨痰进行GeneXpert 法和RD1-RD3 胶体金法检测。试验组5 mL 肺泡灌洗液进行涂片、培养、GeneXpert 法和RD1-RD3 胶体金法检测。从5 mL 肺泡灌洗液中吸取0.05 mL 涂片，经抗酸染色镜检抗酸杆菌。再取灌洗液2 mL，加入等量4% 氢氧化钠处理15 分钟，进行结核分枝杆菌分离培养。另取肺泡灌洗液1 mL 放在防漏的收集器皿中，加入GeneXpert 处理液2 mL，盖紧剧烈摇动10 ～20次，室温处理15 分钟后，用无菌吸管吸取2 mL，加入GeneXpert Cartridge 中的标本孔中，盖紧盖子后上机开始检测。剩余肺泡灌洗液进行RD1-RD3 胶体金法检测。

1.5 仪器与试剂

GeneXpert MTB/RIF 系统由美国Cepheid 公司生产，试剂盒原装进口，批号：16201，由天津仪美科技有限公司提供。RD1-RD3 胶体金法试剂由济南杏恩生物科技有限公司生产。

1.6 结果判定

抗酸染色镜检根据涂片抗酸杆菌菌量多少判定为4+、3+、2+、1+、阴性；结核分枝杆菌分离培养根据固体培养基斜面菌量多少判定为4+、3+、2+、1+、阴性；GeneXpert 法结果根据探针的循环阈值（ct 值）判断，ct 值≤38 即为检测到结核分枝杆菌，可进一步按照ct 值对结核分枝杆菌进行半定量，ct 值＜16为高含量，ct 值16 ～22 为中含量，ct 值23 ～28 为低含量，ct 值＞28 为极低含量[3]；RD1-RD3 胶体金法的肺泡灌洗液经过试纸条的虹吸后，反应液会向试纸卡上方移动, 待样品液体虹吸上移并通过C 线位置后，15 分钟内判读结果，C 区和T 区同时出现红线为阳性，仅C 区出现而T 区未出现则为阴性。

1.7 统计学处理

建立Excel 2010 数据库收集数据，应用SPSS 17.0 软件进行统计学处理分析，阳性检出率采用百分比（%）表示，组间结果比较采用χ² 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组和试验组晨痰GeneXpert 法和RD1-RD3 胶体金法检测结果的比较

晨痰GeneXpert 法和RD1-RD3 胶体金法检测的特异度分别为100%、96.72%，二者差异无统计学意义（χ²=2.033，P=0.154）；晨痰GeneXpert 法和RD1-RD3 胶体金法检测的敏感度分别为13.79%（12/87）和11.49%（10/87），二者差异无统计学意义（χ²=0.208，P=0.648）。详见表1。

表1 对照组和试验组晨痰GeneXpert 法和RD1-RD3 胶体金法检测的结果（例）

2.2 试验组肺泡灌洗液四种方法检测结果的比较

试验组87 例菌阴肺结核患者肺泡灌洗液涂片、培养、GeneXpert 和RD1-RD3 胶体金法检测的阳性率分别为10.34%、18.39%、44.83% 和42.53%。结果详见表2。RD1-RD3 胶体金法与涂片和培养的结果相比，差异均有统计学意义（χ²=23.168、11.965，P=0.000）；RD1-RD3 胶体金法与GeneXpert 法的结果相比，差异无统计学意义（χ²=0.093，P=0.760）。详见表2。

表2 试验组87 例患者肺泡灌洗液四种方法检测的结果[例(%)]

试验组87 例患者肺泡灌洗液检测以培养结果为金标准，涂片法的敏感度、特异度、假阳性率和假阴性率分别为56.25%（9/16）、100%（71/71）、0%（0/71）和43.75%（7/16）。GeneXpert 法的敏感度、特异度、假阳性率和假阴性率分别为 100%（16/16）、67.61%（48/71）、32.39%（23/71）和0%（0/16）。RD1-RD3胶体金法的敏感度、特异度、假阳性率和假阴性率分别为100%（16/16）、70.42%（50/71）、29.58%（21/71）和0%（0/16）。详见表3。

表3 三种方法敏感度、特异度、假阳性率和假阴性率的分析（例）

2.3 试验组87 例患者同期晨痰和肺泡灌洗液检测结果的比较

试验组87 例患者晨痰和肺泡灌洗液GeneXpert法检出阳性例数分别为12 例和39 例，两者比较差异有统计学意义（χ²=20.3448，P=0.000）；RD1-RD3胶体金法检出阳性例数分别为10 例和37 例，两者比较差异有统计学意义（χ²=21.251，P=0.000）。

3 讨论

菌阴肺结核是指经痰涂片抗酸染色镜检和痰结核分枝杆菌分离培养均阴性的肺结核。有研究指出，涂片和培养结核分枝杆菌的阳性或阴性检出会受到以下因素的影响：（1）标本的质量和性质；（2）病变在肺野的位置；（3）病变是封闭或开放；（4）病变的性质和其中能够排出的菌量及排出时间间隔；（5）结核分枝杆菌存在的形态；（6）培养标本含有的菌量和是否为活菌；（7）培养前处理的过程中，结核分枝杆菌损伤的程度；（8）培养基营养成分的有限性等[4]。由于菌阴肺结核较难获得细菌学依据，因此其临床确诊存在较大的难度。

涂片和培养法是实验室重要的检测方法，但因敏感度较低，不能满足临床的需要。本研究结果显示，虽然菌阴肺结核痰涂片和培养均阴性，但晨痰经GeneXpert 法和RD1-RD3 胶体金法检测后，其阳性率分别为13.79%（12/87）和11.49%（10/87），肺泡灌洗液的阳性率分别为44.83% 和42.53%，肺泡灌洗液的阳性检出率显著高于涂片和培养法结果。患者同期的晨痰和肺泡灌洗液检测结果相比，肺泡灌洗液的阳性检出率显著高于晨痰。可见GeneXpert 法和RD1-RD3 胶体金法均具有可检测含菌量较少标本的优势，且均具有较高的特异度和敏感度。

结核分枝杆菌基因组学研究显示，结核分枝杆菌差异区（region of differences,RD）只存在于结核分枝杆菌复合群及其他几种致病性结核分枝杆菌中，其中RD1-RD3 区编码蛋白仅存在于致病性结核分枝杆菌中。因此，RD1-RD3 抗原胶体金法对诊断结核病具有较高的特异性和敏感性[5-6]。GeneXpert 技术以半巢式实时定量PCR 技术为基础，样品准备、DNA 扩增和检测完全实现自动化，GeneXpert 对目标DNA 序列的检测具有高度光学敏感性，实时的光学监测使得软件可以一经发现目标序列就给出结果。有报道称，GeneXpert 技术对诊断肺结核和肺外结核均有较高的特异度和敏感度[7-9]。

综上所述，GeneXpert 法和RD1-RD3 抗原胶体金法均具有较高的特异度和敏感度，但在实际应用中GeneXpert 法所用仪器和试剂盒昂贵，成本较大，而RD1-RD3 抗原胶体金法具有操作简便、快速，成本较低等优点。因而，RD1-RD3 抗原胶体金法在辅助诊断菌阴肺结核中具有较高的应用价值，且尤其适合在基层结核病防治机构推广应用。