丹参注射液通过诱导自噬抑制足细胞凋亡的研究

曾 慧，陈文良，黄文治

（广东省中医院，广东 广州 510120）

丹参注射液（Danshen injection, DSI）是一种从中药丹参中提取的制剂，具有活血化瘀、通脉养心的功效，在临床上主要用于治疗心血管疾病，如冠心病、心绞痛等[1]。在中医临床上，瘀证是肾病常见的中医证型，而丹参是活血化瘀的代表药味，因而常被临床上用于治疗伴有瘀证的各种肾脏疾病[2-3]。研究表明，丹参中的多种主要成分可调控自噬，进而发挥调控细胞凋亡的作用，例如丹酚酸B 通过抑制细胞自噬和凋亡阻止糖尿病周围神经病变的发展[4]。然而，DSI 对肾细胞自噬及凋亡的影响尚有待于进一步的研究。本文旨在研究足细胞中自噬与凋亡的关系及DSI 的干预作用，以期为DSI 在肾脏疾病中的应用提供体外的实验数据参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DSI（正大青春宝药业有限公司）；脂多糖（Sigma）；氯喹（Sigma）；雷帕霉素（Sigma）；P62抗体（Abcam）；Beclin1 抗体（CST）；β-actin 抗体（Abcam）；Caspase 3 抗体（CST）；Bax 抗体（CST）；Bcl-2 抗体（CST）；兔二抗（Abcam）；鼠二抗（Abcam）；BCA 测试盒（上海碧云天生物技术有限公司）；RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、Loading Buffer（康为世纪生物科技股份有限公司）；ECL 超敏发光液、0.45 μm PVDF 膜（Millipore）；MPC-5 细胞（上海酶研生物科技有限公司）；培养基（Gibco）；双抗（Gibco）；胎牛血清（Biological Industries）；全波长酶标仪（Thermo）；光学倒置显微镜（Olympus）；全自动化学发光图像分析系统（Tanon）。

1.2 细胞培养及干预

足细胞系MPC-5 购自上海酶研生物科技有限公司。使用RPMI-1640 培养基（10%胎牛血清，1%双抗，50 U/mL INF-γ）培养足细胞，置于5% CO2的33 ℃恒温培养箱中培养增殖。分化培养时，用RPMI-1640 培养基（10% 胎牛血清，1% 双抗，1×Insulin-Transferrin-Selenium）培养，置于5% CO2的37℃恒温培养箱中培养14 d。脂多糖粉末用生理盐水配置为10 mg/mL 的母液，DSI 原液用生理盐水配置成不同稀释比的浓度。根据前期实验探索[5]，脂多糖造模浓度为4 μg/mL，DSI 稀释比为1/640，氯喹最终干预浓度为20 μM，雷帕霉素的最终干预浓度为20 nM。

1.3 细胞总蛋白提取实验

细胞实验干预结束后，用PBS 预冷溶液润洗培养板3 次，加入预冷裂解液（RIPA ：100× 蛋白酶抑制剂=99:1），80 μL/ 孔，将细胞刮下后收集至1.5 mL EP 管中，冰上裂解30 min，然后在4 ℃下以12 000 rpm 的转速离心20 min，收集上清，用BCA 试剂盒检测总蛋白浓度，用生理盐水及Loading Buffer 将所有样品配置为1 μg/mL 的终浓度。

1.4 Westernblotting 检测

配置10% 的SDS-PAGE 分离凝胶系统，每孔上10 μL 制备好的蛋白样品，垂直电泳槽1×电泳液中150 V 恒流电泳70 min。将凝胶上的蛋白通过200 mA恒流电泳60 min，使之转印到0.45 μm 的PVDF 膜上。用5%的脱脂奶粉封闭1 h 后，4 ℃摇床慢速摇动孵育一抗过夜。次日用TBST 清洗2 次，每次10 min，孵育二抗1 h。再次用TBST 清洗2 次，每次10 min，用超敏发光液ECL 浸润30 s 后在化学发光成像系统中显影采集。得到的图像通过ImageJ 1.53K 软件统计灰度值，并与内参进行半定量比较。各抗体稀释比如下：P62 抗体（1:1000）；Beclin1 抗体（1:1000）；β-actin抗体（1:1000）；Caspase 3 抗体（1:1000）；Bax 抗体（1:1000）；Bcl-2 抗体（1:1000）；兔二抗（1:5000）；鼠二抗（1:5000）。

1.5 统计学方法

使用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，所有数据均以均数± 标准差（±s）显示，在满足正态性检验及方差齐性检验条件时（本文数据均满足该条件），采用非配对的t检验进行两组间的比较。当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氯喹及雷帕霉素联合DSI 干预对足细胞自噬的影响

为进一步探究DSI 对脂多糖诱导的足细胞凋亡及自噬的影响，我们给予氯喹及雷帕霉素干预，结果显示，氯喹能够促进P62 蛋白的表达，雷帕霉素则能下调P62 蛋白的表达水平及上调Beclin1 蛋白的表达水平，表明氯喹抑制了足细胞的自噬，而雷帕霉素则诱导了足细胞的自噬。与氯喹组相比，给予氯喹和DSI干预后足细胞的自噬水平明显上调。与雷帕霉素组相比，给予雷帕霉素和DSI 干预后足细胞的自噬水平也出现明显上调的趋势（见图1）。这一结果表明，DSI能够逆转氯喹造成的自噬阻滞，其激活自噬的活性与雷帕霉素有协同作用。

图1 氯喹与雷帕霉素干预对足细胞自噬的影响及联合DSI 的作用

2.2 DSI 通过干预自噬影响足细胞的凋亡

以氯喹及雷帕霉素干预后，评价DSI 对足细胞凋亡的影响，结果显示，氯喹抑制了Caspase 3、Bcl-2 蛋白的表达，同时给予氯喹及DSI 干预后，Caspase3、Bcl-2 蛋白的表达上升，Bax 蛋白的表达下降。给予雷帕霉素诱导自噬后，足细胞的凋亡出现了明显的上调趋势。同时给予DSI 干预，足细胞的Caspase 3、Bax 蛋白水平显著下降，Bcl-2 蛋白水平显著上调。这一结果表明诱导足细胞自噬能够抑制脂多糖导致的足细胞凋亡损伤，而抑制自噬则会导致脂多糖诱导的足细胞凋亡损伤加重（见图2）。

图2 氯喹与雷帕霉素干预对脂多糖诱导的足细胞损伤自噬的影响

3 讨论

自噬和凋亡是细胞重要的生理活动，密切参与肾脏疾病的发展[6]。在肾脏中，足细胞是组成肾小球滤过屏障的重要细胞[7]。因而，足细胞的自噬和凋亡将直接影响肾脏滤过屏障的完整性。在脂多糖刺激的炎症模型中，足细胞的自噬受损，此时细胞凋亡水平上升。自噬通过及时收集、降解细胞内的受损细胞器或翻译错误的大分子等，从而实现细胞内的物质循环[8]。当足细胞的自噬受损后，物质循环效率降低，进一步导致细胞凋亡，形成恶性循环。此外，给予DSI 和自噬激动剂诱导足细胞自噬后，细胞凋亡水平明显下降。表明在脂多糖模型中，自噬是起保护足细胞的作用，而DSI 则可以通过诱导自噬抑制足细胞凋亡。本研究通过应用自噬抑制剂和激动剂，阐明了足细胞自噬水平与细胞凋亡之间的关系。

综上所述，本研究从足细胞自噬诱导凋亡的角度阐明了DSI 在肾脏保护中的作用机制，为扩大DSI 的临床应用及肾脏疾病的治疗提供了新思路。