53例开放性手部及前臂外伤厌氧菌感染临床及病原学特征

苏玉,孙丽颖,刘颖(北京积水潭医院.医学检验中心,.手外科,北京100035)

感染是手和前臂开放性外伤主要的并发症之一,引起感染的常见菌包括金黄色葡萄球菌、多杀巴斯德菌、链球菌属等[1]。厌氧菌感染的独立分析研究极少,可能与厌氧培养、病原学鉴定的实验室技术要求高有关。虽然大多数厌氧菌毒力较弱,患者的初始症状隐匿,但是如诊治不及时,可发生屈指肌腱鞘炎、脓毒性关节炎,导致手部功能障碍[2]。少数毒力极强的厌氧菌(如A型产气荚膜梭菌等梭菌属细菌)延诊可导致创伤性气性坏疽,致使患者截肢甚至危及生命[2-3]。所以对于手部和前臂开放性外伤发生的感染,厌氧菌的分析研究十分必要。本研究对53例手部及前臂厌氧菌感染患者的临床和病原学资料进行了回顾性分析,并对厌氧菌药敏结果进行分析,为开放性手部及前臂创伤相关的厌氧菌感染提供诊断和治疗依据。

1 对象和方法

1.1研究对象 回顾性分析2015年1月—2021年12月就诊于北京积水潭医院的开放性手部和前臂外伤患者,纳入全部术中取材送检发现至少存在1种厌氧菌感染者,并排除3 d内使用抗菌药物治疗的患者和术中送检标本数少于3份的患者,共53例患者纳入分析。术前消毒程序遵守医院骨科标准消毒程序(GB 15982-2012)。收集性别、年龄、基础疾病、受伤原因、临床表现、实验室指标等临床数据,以及病原学鉴定和药敏试验结果数据。本研究符合《赫尔辛基宣言》的原则并且通过本院伦理委员会审查(批文号:202102-10)。

53例患者年龄范围5～83岁,中位年龄56岁;男性41例,女性12例;有基础疾病(糖尿病、高血压)患者14例;受伤原因为直接或间接咬伤(动物咬伤、人咬伤、牙签刺伤等)共39例,利器伤、机械伤或车祸伤14例;感染指标中,白细胞升高(>9.50×109/L)31例,中性粒细胞百分比升高(>75%)30例;根据临床表现,局部感染表现(红肿、流脓、窦道形成)49例,发生感染部位坏死4例。

1.2主要仪器与试剂 MALDI-TOF质谱仪(德国布鲁克公司),SimpliAmp PCR仪(美国ABI公司);CDC厌氧菌血琼脂培养基(2015-2020年购于天津市金章科技公司,2021年购于江门市凯林贸易有限公司),厌氧环境指示剂(法国生物梅里埃公司),DNeasy PowerLyzer细菌DNA提取试剂盒(德国Qiangen公司),PCR预混液(赛默飞世尔公司),甲硝唑和莫西沙星药敏试条(意大利Liofilchem公司),亚胺培南等其他药敏试条(中国温州康泰生物公司),引物合成(上海生工生物公司),PCR产物测序(北京博迈德基因技术有限公司)。

1.3标本采集和厌氧培养 标本采集及厌氧培养操作流程遵循美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)标准M56-A[4]。至少采集患者术中感染组织样本3份,立刻送至实验室进行需氧、微需氧、厌氧培养,覆盖普通细菌、微需氧菌、真菌及专性厌氧菌。对于厌氧培养,接收厌氧标本后立即接种于CDC厌氧菌血琼脂培养基,置于35～37 ℃的厌氧袋。至少经过48 h初代培养(产气荚膜梭菌16～18 h),观察初代培养基上不同形态的菌落,并进行革兰染色,对疑似厌氧菌的菌落进行2次耐氧试验,以排除兼性厌氧菌。2次耐氧试验为阴性的细菌确定为专性厌氧菌。大于或等于3份样本中生长同一种菌确定为致病菌。

1.4细菌鉴定 用MALDI-TOF质谱仪进行厌氧菌和非厌氧菌鉴定,操作依据仪器说明书,鉴定分值≥2.0的菌株结果可信,分值在1.700～1.999的菌株使用16S rRNA基因测序复核。仅发现部分微小小单孢菌或小韦荣球菌需作测序复核,从上述细菌培养平皿刮取菌落,用pH 8.0 TE缓冲液配制1.5×107CFU/mL菌液浓度,取300 μL菌液使用商品化试剂盒进行DNA提取;引物设计参照GenBank中微小小单胞菌3119B株(序列号:NR_036934.1)等18株微小小单胞菌序列、小韦荣球菌DMS2008株(序列号:NR_074980.1)等10株小韦荣球菌序列,以及参考文献报道方法[5-6],采用Primer Premier 5.0和Clustal FW1.8软件辅助设计,正向引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物:5′-ACGGMTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系共25 μL,包括DNA模板2 μL,20 μmol/L正、反向引物各1 μL,2×PCR预混液12.5 μL,无核酸酶水8.5 μL。PCR反应参数:94 ℃预变性7 min;94 ℃变性1 min,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共35个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物及原引物外送测序,经15 g/L琼脂糖凝胶电泳、纯化回收目的片段后使用ABI 3730xl测序仪双向测通,测序结果使用DNASTAR Lasergene v7.1组件处理:EditSeq查看序列;SeqMan拼接序列;微小小单胞菌、小韦荣球菌序列用MegAlign分别与序列NR_036934.1和序列NR_074980.1进行比对,其间所需序列格式转换采用SeqVeter1.4。

1.5抗菌药物敏感性试验 用E-test法测定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)。依据CLSI标准M11-A8选择药物种类[7],包括甲硝唑、阿莫西林/克拉维酸、亚胺培南、美罗培南、莫西沙星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松。使用商品化的含有不同浓度的药敏试条,实验操作遵循参考文献[4,7],将试条与厌氧菌进行35～37 ℃厌氧培养,42～48 h后读取MIC值。结果判定参照CLSI标准M11-A8[7]。

1.6统计学分析 使用Excel 2017和SPSS 26.0软件进行。计量资料采用M(P25,P75)表示;计数资料以n(%)表示。

2 结果

2.1感染类型 53例患者可细分为6种感染类型:1种厌氧菌感染的病例较少,仅有6例(占11.3%);2种厌氧菌感染的4例(占3.8%);3种厌氧菌感染的3例(占5.7%);1种厌氧菌+1种非厌氧菌感染最多,共28例(占52.8%);1种厌氧菌+2种非厌氧菌9例(占17.0%);2种厌氧菌+2种非厌氧菌的3例(占5.7%)。53例患者中存在2种及以上细菌感染的共47例(占88.7%)。

2.2厌氧菌种类分布 53例患者共分离出26种66株厌氧菌,其中,革兰阴性杆菌12种36株,革兰阳性球菌5种15株,革兰阳性芽胞杆菌6种8株,革兰阴性球菌1种5株,革兰阳性杆菌2种2株。见表1。

表1 26种66株厌氧菌种类及分布

2.3受伤原因与厌氧菌种类的关系 受伤原因为直接或间接咬伤的患者中,共分离出19种50株厌氧菌,占厌氧菌总株数的75.8%,其中39株为革兰阴性菌,11株为革兰阳性菌;从利器伤、机械伤或车祸伤患者中分离出11种16株厌氧菌,占24.2%,其中14株为革兰阳性菌,2株为革兰阴性菌。见表2。

表2 受伤原因与厌氧菌种类分布

2.4非厌氧菌种类与分布 53例患者中,共分离出22种49株非厌氧菌,依次为咽峡炎链球菌9株、粪肠球菌5株、中间链球菌4株、表皮葡萄球菌3株、阴沟肠杆菌3株、肺炎克雷伯菌3株、多杀巴斯德菌2株、产酸克雷伯菌2株、星座链球菌2株、金黄色葡萄球菌2株、铜绿假单胞菌2株、大肠埃希菌2株、弗氏柠檬酸杆菌1株、缓症链球菌1株、雷氏普罗威登斯菌1株、门多撒假单胞菌1株、嗜水气单胞菌1株、停乳链球菌1株、图列茨放线菌1株、魏氏柠檬酸杆菌1株、无乳链球菌1株、血链球菌1株。

2.5主要革兰阴性厌氧杆菌的药物敏感性试验 5种23株非拟杆菌群的革兰阴性厌氧菌包括中间普雷沃7株、具核梭杆菌6株、小韦荣球菌5株和产黑普雷沃菌5株。药敏试验结果显示,其中22株菌对亚胺培南、美罗培南及甲硝唑的MIC值≤0.5 μg/mL,21株菌对哌拉西林/他唑巴坦的MIC值≤0.5 μg/mL,20株菌对阿莫西林/棒酸、莫西沙星的MIC值≤0.5 μg/mL,16株菌对头孢曲松的MIC值≤0.5 μg/mL。见表3。

表3 5种23株非拟杆菌群的革兰阴性厌氧菌药敏试验结果[n(%)]

其次对5株脆弱拟杆菌的药敏结果进行分析,发现4株对甲硝唑的MIC值≤0.5 μg/mL,3株菌对亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦的MIC值≤0.5 μg/mL,2株菌对阿莫西林/棒酸、莫西沙星的MIC值≤0.5 μg/mL,对头孢曲松的MIC值≥1 μg/mL。见表4。

表4 5株脆弱拟杆菌药敏试验结果[n(%)]

3 讨论

本研究共培养出厌氧菌26种,非厌氧菌22种,厌氧菌和非厌氧菌的混合感染占75.5%,说明同时进行厌氧菌和非厌氧菌的培养和鉴定具有重要临床意义。

此外,本研究发现细菌种类与受伤原因直接相关。直接或间接咬伤是发生厌氧菌感染的主要原因,其中革兰阴性菌占比较高,主要为人或动物口腔来源的厌氧菌(如中间普雷沃菌、具核梭杆菌、产黑普雷沃菌等);而来源于外部环境的厌氧菌中革兰阳性菌占比高(如梭菌属的厌氧菌、海氏嗜胨菌、厌氧消化链球菌等)。受伤原因可对判断感染部位的细菌种类起到重要的参考作用。

革兰阴性厌氧杆菌是本研究中主要出现的厌氧菌类型。在分析主要革兰阴性厌氧杆菌的药敏结果时,因拟杆菌群易产生β-内酰胺酶,所以将脆弱拟杆菌进行单独分析[8]。革兰阴性厌氧菌首选抗菌药物依次为甲硝唑、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林/他唑巴坦。但因混合感染比例高,细菌种类复杂,如单纯使用甲硝唑不能覆盖所有病原菌种类,更建议使用超广谱抗菌药物。对于非拟杆菌群的厌氧菌,头孢曲松的MIC值更低,而拟杆菌群的MIC值更高,说明头孢曲松更适用于非拟杆菌群的厌氧菌感染治疗。

手部和前臂的厌氧菌感染并不罕见,但文献报道极少,本研究为开放性手部及前臂创伤相关的厌氧菌感染提供诊断和治疗依据。本研究来自单中心数据,未来尚需扩大样本量并进行多中心研究。