复杂性区域疼痛综合征病人自身抗体在体外诱导内皮细胞促炎作用和功能紊乱

一、研究背景

复杂性区域疼痛综合征(complex regional pain syndrome, CRPS)是一种罕见的肢体外伤性手术并发症，可导致受累肢体严重疼痛，除此之外，还表现为感觉运动功能障碍，并伴有自主神经和营养变化，例如水肿和体温调节血流受损。在大约1/3 的病人中，慢性疼痛导致无法使用受影响的肢体。此外，血管改变和内皮功能障碍在CRPS 的病理生理中起主要作用。据既往研究报道，在患有慢性CRPS 疾病的病人皮肤组织中存在着血管完整性丧失、皮肤神经支配改变和皮肤脉管系统的病理变化。除此之外，还发现了进一步的病理生理机制：①外周免疫系统的过度激活（如促炎细胞因子的释放）和初级传入纤维的致敏；②中枢神经系统神经元加工的紊乱，可能与疼痛致敏、运动障碍和身体知觉紊乱有关。此外，已经描述了交感神经系统神经支配模式的变化，这可能是由周围炎症，对创伤的中央神经系统反应或由于最近确定的周围免疫机制引起的。该研究小组和其他小组已经确定了直接针对自主神经系统受体的自身抗体包括：M2 受体 (M2R)、肾上腺素β2 受体 (β2AR) 和去甲肾上腺素 α1 受体。除了作为有用的诊断工具外，一些受体自身抗体在体外还具有致病作用，例如自身免疫性心肌病的抗β1 受体和自身免疫性自主神经病变的抗α3 乙酰胆碱受体。有趣的是，乙酰胆碱和肾上腺素受体均参与伤害感受、炎症和自主神经功能。HLA-DQ1 和HLA-DR13 与CRPS 的关联进一步支持了免疫生理学的假设。

β2AR 和M2R 主要表达于内皮细胞、平滑肌细胞和成骨细胞。由于内皮功能障碍在CRPS 的病理生理中起主要作用，并且CRPS-IgG 的被动转移导致小鼠后肢切口模型水肿形成增加，针对β2AR 或M2R 的自身抗体对内皮细胞的影响似乎很可能。既往描述了通过肾上腺素能和毒蕈碱受体激活第二信使途径（如ERK1/2 或p38）。ERK1/2 调节内皮细胞的增殖和迁移，而p38 在调节氧化应激反应中的内皮细胞功能中起着核心作用，STAT 是导致内皮细胞功能障碍的重要致病机制，使它们成为内皮功能的重要调节剂。细胞间黏附分子1 (ICAM-1) 和血管细胞黏附分子1 (VCAM-1) 参与白细胞迁移和与内皮细胞的相互作用。这些细胞黏附标志物在炎症事件期间上调，过度激活可能导致内皮细胞永久性功能障碍。因此，应详细研究自身抗体对第二信使途径和内皮细胞黏附分子的影响。该试验研究了针对β2AR 和M2R 的CRPS 病人的自身抗体对内皮细胞的功能作用，以及这种作用是如何介导的。

二、研究方法

为了测试病人血清中与内皮细胞的表面结合自身抗体，分离了IgG 组分，并通过流式细胞术在2种内皮细胞系上评估了结合：人脑微血管内皮细胞系 (hCMEC/D3) 和人脐静脉内皮细胞 (huvec)。抗β2AR 和M2R 的受体自身抗体在CRPS 中已有描述。该研究使用转染这些受体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 来评估IgG 组分的结合特异性。此外，通过添加特异性受体拮抗剂（用于M2 的阿托品和用于β2 受体的普萘洛尔）进行药理学阻断来证明结合特异性。由于结合研究具有可比性，并且hCMEC/d3显示β2 和M2 受体的表达高于HUVEC，因此使用hCMEC/d3 进行功能测定。

进行增殖和细胞毒性测定以确定自身抗体是否能够影响内皮细胞活力。接下来，检测了自身抗体对不同第二信使途径（尤其是MAPK 途径）的影响，以及在功能障碍或炎症后激活的内皮细胞表面表达的ICAM-1 和VCAM-1 的变化。补充材料（可在http://links.lww.com/PAIN/B615 获得）中详细描述了常见的技术（如细胞培养、IgG 纯化和实时PCR）。

1.IgG 纯化

根据IASP 研究诊断标准，获得德国（批准编号：4208 [2004]）莱茵兰当地伦理委员会的书面知情同意和批准。血清来自13 例临床定义的CRPS 病人（7名女性和6 名男性，平均年龄49.0±16.1 岁，招募间隔：4 年）；11 名健康对照者（HCs；6 名女性和5 名男性，平均年龄51.5±7.7 岁），7 名radial骨骨折病人（RF；4 名女性和3 名男性，平均年龄50.5±9.9 岁）和10 名周围动脉血管疾病病人（VD；5 名男性和5 名女性，平均年龄53.3±5.9 岁，无自身免疫病史）作为对照受试者。使用HiTrapProtein-G柱进行IgG 纯化，并将IgG 稀释至最终浓度为1 g/L。HCs 或radial 骨骨折病人均无慢性疼痛史。

2.自身抗体的表征

为了分析病人的IgG 是否具有针对人β2AR和人M2R 的功能性自身抗体，使用稳定转染的CHO 细胞过表达这些受体（hβ2AR-CHO 和hM2RCHO），HUVEC，hCMEC/D3，16 和HEK293 作为对照细胞系。受体表达通过免疫印迹证实。HEK293显示出hM2R 的高表达；因此，用CHRM2-siRNA（胆碱能受体毒蕈碱2，编码hM2R）转染它们，以防止与M2R 的非特异性抗体结合。

纯化的IgG (1 g/L) 与野生型CHO 细胞吸收以减少非特异性结合，流式细胞术用于检测表面结合抗体，如前所述。与细胞表面结合的抗体表示为平均荧光强度。当它们显示出比HCs 的平均值12.5倍SD 更高的抗体结合时受试者被认为是阳性的。

为了验证特异性IgG 结合，将hβ2AR-CHO，hM2RCHO 和hCMEC/D3 细 胞 与βAR antagonist（1 mM (±)-盐酸普萘洛尔；SigmaAldrich，圣路易斯，密苏里州）或M2R 拮抗剂 (1 mM atropine;Sigma-Aldrich)孵育，然后添加IgG 组分。再将细胞进行细胞外流式细胞术，如上所述。

为了选择最有效的细胞系进行分析，首先研究了2 种不同的内皮细胞系：永生化hCMEC/D3 和原代分离脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并分析了目标受体hβ2AR 和hM2R 的表达。由于hCMEC/D3 细胞与HUVEC 相比，这两种受体的表达都要高得多，而CRPS-IgG 与hCMEC/D3 细胞的结合要强得多，因此功能影响的试验是在hCMEC/D3 细胞上进行的。VD 病人被排除为对照组，因为他们的IgG 完全不与内皮细胞表面结合，因此不应该影响内皮细胞的功能。为了减少非特异性作用，CRPSIgG 与HEK293 细胞预孵育以减少非特异性结合（详细数据可在http://links.lww.com/PAIN/B615 上获得）。

三、研究结果

1.CRPS 病人的临床和流行病学资料

纳入的13 例CRPS 病人；在没有事先了解临床或血清学特性的情况下，盲法选择血清。女性7例，男性6 例，平均年龄(49.0±16.1)岁，发病至抽取血清1～170 周。疼痛评分在2～9 之间，这可能提示一些长期CRPS 病人的疼痛症状部分缓解。大多数病人病程为3～6 个月（中位数为13 周），大多数病人的CRPS 为I 型。有10 例病人出现了明显的水肿，但还没有进一步的量化。

2.CRPS 病人具有针对肾上腺素能受体和毒蕈碱受体及内皮细胞的特异性自身抗体

RFs 或hcc 病人的CRPS-IgG 与hβ2AR 和hM2R特异性结合：hβ2AR-CHO 细胞和hM2R-CHO 细胞。经β 受体阻滞剂心得安或M 受体阻断剂阿托品预孵育后，CRPS-IgG 与hβ2AR-CHO 和hM2R-CHO 细胞的结合显著降低。

3.来自CRPS 病人的IgG 与hCMEC/D3 内 皮 细胞上的hβ2AR 和hM2R 结合

检测内皮细胞株hCMEC/D3 和HUVEC 中hβ2AR和hM2R 的蛋白水平和mRNA 水平。两种细胞系均在mRNA 和蛋白水平上表达hβ2AR 和hM2R，但hCMEC/D3 细胞中hβ2AR 和hM2R 的表达高于HUVEC。与HC、RF 和VD 相 比，CRPS 病人的IgG 与hCMEC/D3 和HUVEC 的结合明显更高。当细胞与hβ2AR 和hM2R 拮抗剂预孵育时，CRPS-IgG与hCMEC/D3 细胞的结合亲和力强度显著降低，表明观察到的结合是hβ2AR 和hM2R 特异性的。

4.来自CRPS 病人的IgG 会增加内皮细胞的细胞毒性，降低内皮细胞的活性

通过LDH 释放、WST-1 对细胞增殖率的影响，分析HC-IgG、CRPS-IgG、RF-IgG 对hCMEC/D3细胞的细胞毒作用。与HC-IgG 和RF-IgG 相比，CRPS-IgG 孵育hCMEC/D3 细胞可诱导明显更高的细胞毒作用（CRPS 14.9±5.64vs.HC 1.49±3.87vs.RF 12.81±2.71，P< 0.001）。βAR 和M2R 拮抗剂预孵育可降低这一效应，但不显著（CRPS 14.90±5.64vs.CRPS + 1 mM 普萘洛尔8.84±7.66vs.CRPS +1 mM 马特洛平9.88±7.24，P= 0.07）。CRPS-IgG刺激hCMEC/D3 细胞的增殖率低于HCIgG 和RF-IgG（CRPS 11.55±3.14vs.HC 16.74±0.54vs.RF 16.94±0.40，P< 0.001）。当在CRPS-IgG 之前加入bAR 或M2R 拮抗剂时，对增殖的抑制作用被显著拮抗，表明这种作用是通过这些抗体介导的（CRPS 11.55±3.143vs.CRPS 11 mM(±)-普萘洛尔13.95±2.021，P< 0.01 和CRPS 11.55±3.143vs.CRPS + 1 mM 阿托品14.58± 1.747，P< 0.001）。

5.CRPS-IgG 导致内皮细胞向促炎状态转变

用HC-IgG、CRPS-IgG 和RF-IgG 刺激hCMEC/D3细胞24 h，RT-PCR 检测促炎表面蛋白ICAM-1 和VCAM-1 的相对基因表达。所有数据均归一化为GAPDH。此外，还分析了CRPS-IgG 对第二信使通路ERK1/2、p38、STAT-1 和AKT 磷酸化的影响。

所有数据使用BIO-ID 软件进行量化，并归一化为各自的总蛋白，如总STAT-1、p38、AKT 和ERK1/2。空白设置为1（单个结果见补充S2-S5，可在http://links.lww.com/PAIN/ B615 上获得）。

CRPS-IgG 刺 激 的hCMEC/D3 细 胞 在mRNA 水平上表达ICAM-1 (P< 0.001)和VCAM-1 (P< 0.05)。与HC-IgG 刺激的细胞相比，CRPS-IgG 刺激的hCMEC/D3 细胞促进ERK1/2 磷酸化显著增加3～4 倍(P< 0.001)。用CRPS-IgG 而不是HC-IgG 处理细胞后，也观察到类似的磷酸化p38 水平升高3 倍(P<0.001)。还分析了促炎介质pSTAT-1 的水平，并观察到内皮细胞与CRPS-IgG 孵育后磷酸化增加了4～5 倍，而HC-IgG 没有显示出任何影响。此外，CRPS-IgG 刺激的hCMEC/D3 细胞显示AKT 磷酸化显著下调(P< 0.001)。此外，分析了这些对炎症标志物的影响是否可以使用各自的拮抗剂逆转。用βAR 拮抗剂（1 mM 盐酸普萘洛尔）或M2R 拮抗剂（1 mM 阿托品）预处理hCMEC/D3 细胞能够消除对pERK1/2 磷酸化(P< 0.001)、磷酸化p38 (P< 0.001)、pSTAT-1 (P< 0.001)和pAKT (P< 0.001)的影响。

四、讨论

CRPS 是一种慢性疼痛综合征，其病理生理学机制只了解一部分。近年来，越来越多的证据表明自身免疫性创伤过程已被检测到。这包括局部创伤后炎症，也包括免疫紊乱。针对自主神经系统受体（β2-肾上腺素受体、α1-肾上腺素受体和M2 毒蕈碱乙酰胆碱受体）的自身抗体在体外对交感神经元具有功能影响，既往已被发现。将CRPS-IgG 转移到小鼠体内导致痛觉感受器的致敏性增加，不仅在后腿切口动物模型中如此，而且在使用CRPS-IgG处理的小鼠皮肤神经制剂的离体实验中也是如此。此外，被动地将CRPS-IgG 转移到小鼠体内会引起行为障碍，支持了这些抗体具有功能活性的假设。病人的IgG 被动转移到小鼠诱导典型症状，这强调了自身抗体在CRPS 发展中的相关性。CRPS 中自身抗体的来源尚不清楚。然而，越来越多的证据表明，创伤使生理上惰性蛋白质或其片段暴露于免疫系统，导致自身抗体的产生。分子拟态可能是这些自身抗体靶向的原因。在该研究中证实了早期的发现，CRPS 病人产生了针对自主神经系统受体的IgG 自身抗体。进一步研究表明，这些自身抗体在HCs 或桡骨骨折或血管疾病病人的血清中检测不到。尽管炎症在血管疾病的病理生理学中起着重要的作用，而且自身抗体也在血管疾病中被描述（如抗心磷脂的自身抗体），但这些情况似乎不会引发针对该研究分析的受体的自身抗体。

抗β2AR 和M2R 抗体也在其他自身免疫性疾病中发现（如自身免疫性心肌病），因此它们似乎不是CRPS 特异性的。肾上腺素受体和毒蕈碱受体可能在痛觉中起作用。肾上腺素能受体与疼痛之间的相关性已经在前面描述过，并且已经证明疼痛敏感性的增加是通过β2AR 和β3AR 介导的。这些发现支持了CRPS 中的自身抗体通过肾上腺素能或毒蕈碱受体影响疼痛发展的假设。

长期以来，IgM 自身抗体在CRPS 中的作用一直未被关注，但最近研究表明，来自胫骨骨折CRPS 模型小鼠的IgM 被动转移到缺乏成熟B 细胞和免疫球蛋白的小鼠中，导致痛觉疼痛增加。此外，IgM 在患肢皮肤、坐骨神经和腰脊髓中沉积，表明IgM 作为一种促觉因子的作用。IgM 激活补体系统的能力较强可能是维持这一过程的重要因素。CRPS的发展似乎比迄今为止所认为的更为复杂。IgG 对内皮细胞和神经元细胞的作用可能是促进免疫过程所必需的，同时IgM 对痛觉神经元的敏化可能在疼痛发展中起作用。为了阐明CRPS-IgM 和CRPS-IgG的作用，还需要进一步的动物模型研究和更多病人的临床研究。

血管紊乱包括血管张力调节不平衡和毛细血管功能障碍，已在CRPS 病人中表现出来，而CRPS通常与患肢水肿有关。研究发现CRPS-IgG 与内皮细胞表面的hβ2AR 和hM2R 结合。hM2R 和hβ2AR的药物阻断显著降低了抗原的结合，证明了抗原的特异性。众所周知，针对细胞表面结构的自身抗体可能具有功能性活性（如在重症肌无力中）；因此，抗hβ2AR 和hM2R 的自身抗体可能在CRPS 中具有功能性活性。该研究分析了CRPS-IgG 对内皮细胞增殖、细胞毒性和第二信使通路激活的影响。CRPS-IgG 对内皮细胞具有较高的细胞毒性和较低的增殖率，β2AR 拮抗剂普萘洛尔或M2R 拮抗剂阿托品可特异性拮抗内皮细胞增殖，证明其作用是通过这两种受体介导的。系统性硬化症（一种自身免疫性风湿病）病人也会产生抗内皮细胞自身抗体，诱导内皮细胞凋亡。这一发现并非是CRPS 自身抗体所特有的，它也可以出现在其他自身免疫性疾病中。

CRPS-IgG 引起hCMEC/D3 中第二信使ERK1/2、p38 和STAT1 的更高磷酸化，这些信使ERK1/2、p38和STAT1 均参与凋亡、炎症和内皮细胞功能障碍。与此同时，参与增殖的AKT 磷酸化通过CRPS-IgG被抑制，毒蕈碱和肾上腺素能拮抗剂抵消了这些发现。ERK1/2 参与内皮细胞的增殖和迁移，p38 在调节内皮细胞应对氧化应激的功能中起核心作用，STAT 是导致内皮细胞功能障碍的重要致病机制。这些第二信使的明显激活提示自身抗体正在影响体外内皮细胞的功能状态。但必须指出的是，在该研究中使用的是永生细胞，这可能与原代培养的细胞表现不同。在早期的研究中，关于自身抗体功能效应的体外实验是使用表达感兴趣受体的细胞（如心肌细胞）进行的，因此这种研究体外效应的方法是可靠的。

最近报道了一个从CRPS 病人被动转移IgG到小鼠的动物模型，表明IgG 对小鼠的负面影响可以通过IL-1 拮抗剂阿那白滞素治疗消除。发现CRPS-IgG 在体外hCMEC/D3 细胞中增加了ICAM-1和VCAM-1 的表达。这些基因的过度表达可能导致永久性内皮细胞功能障碍；因此，此处发现的明显过表达可能导致血管渗漏情况的增加。由于ICAM-1 和VCAM-1 通 过IL-1 和IL-4 上 调，IL-1拮抗剂阿那白滞素能够减少动物模型中CRPS 样症状的发现可能与通过CRPS-IgG 上调ICAM-1 和VCAM-1 有关。

综上所述，该研究证实了早期的发现，CRPS病人产生了针对自主hβ2AR 和hM2R 的特异性自身抗体，这些抗体也结合到微血管内皮细胞的表面受体上。这些自身抗体在体外对内皮细胞具有功能性影响：①诱导细胞毒性，降低内皮细胞活力；②诱导细胞黏附分子上调，通过显著磷酸化包括MAPK通路在内的几个促炎通路下游靶点，激活各种转录因子，从而使内皮细胞的细胞生存状态急剧下降。因hβ2AR 和hM2R 主要在内皮细胞和平滑肌细胞上表达，这可能部分解释了潜在的，可能是抗体介导的CRPS 病理。然而，该研究的局限性是这些发现仅在体外进行，样本数较少，因此进一步在更大的病人群体中进行研究，并在动物模型中确认这些作用，将有助于进一步了解CRPS的病理生理学机制。