基于TLR4/MyD88/NF-κB信号轴探讨闹羊花毒素Ⅲ对类风湿关节炎的影响

刘笑蓉 李硕夫 刘湘丹 王志辉 曾娟 周日宝

〔摘要〕 目的 本研究旨在探討闹羊花毒素Ⅲ调控TLR4、MyD88和NF-κB的机制，以及闹羊花毒素Ⅲ对类风湿关节炎（rheumatoid arthritis， RA）的影响。方法 RA大鼠模型通过Ⅱ型胶原诱导构建。随机将Wistar大鼠分成6组（n=8）：假手术组（Sham组）、RA模型组（Model组）、阳性药物雷公藤组[TWG组，50 mg·（kg·d）-1]、闹羊花毒素Ⅲ低剂量组[R-Ⅲ Lo组，0.06 mg·（kg·d）-1]、中剂量[R-Ⅲ Mi组，0.12 mg·（kg·d）-1]和高剂量组[R-Ⅲ Hi组，0.24 mg·（kg·d）-1]。测定各组大鼠的关节炎指数（arthritis index， AI）;采用HE染色、ELISA、Western blot和RT-qPCR检测闹羊花毒素Ⅲ对TLR4/MyD88/NF-κB信号轴及RA的影响。结果 与Model组比较，闹羊花毒素Ⅲ处理显著降低了RA大鼠的AI评分（P<0.05）。闹羊花毒素Ⅲ对滑膜组织的恶性增生和炎症细胞浸润有明显的抑制作用。与Model组比，闹羊花毒素Ⅲ各剂量组的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、VEGF、MMP-2、MMP-9、TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB因子的水平降低且呈浓度依赖性（P<0.05）。与TWG组比，R-Ⅲ Lo和R-Ⅲ Mi组的。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、VEGF、MMP-2、MMP-9、TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB因子的水平升高（P<0.05），而R-Ⅲ Hi组无显著差异（P>0.05）。结论 闹羊花毒素Ⅲ可以通过下调TLR4、MyD88、NF-κB因子的表达水平来改善RA。本研究为利用闹羊花毒素Ⅲ治疗RA提供了一定的实验基础。

〔关键词〕 闹羊花毒素Ⅲ;TLR4/MyD88/NF-κB信号轴;类风湿关节炎;羊踯躅;炎症;血管生成

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2023.06.005

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of rhodojaponin Ⅲ on rheumatoid arthritis （RA） by regulating toll-likereceptor 4 （TLR4）， myeloid differentiation factor 88 （MyD88）， and nuclear factor-kappa-B （NF-κB）. Methods Type Ⅱ collagen was used to construct the RA rat model. Wistar rats were randomly divided into 6 groups， with 8 rats in each group： normal feeding group （sham group）， RA model group （Model group）， positive drug tripterygium wilfordii group [TWG group， 50 mg·（kg·d）-1]， low-dose Rhodojaponin Ⅲ group [R-Ⅲ Lo group， 0.06 mg·（kg·d）-1]， medium-dose group [R-Ⅲ Mi group， 0.12 mg·（kg·d）-1]， and high-dose group [Rhodojaponin Ⅲ Hi group， 0.24 mg·（kg·d）-1]. The arthritis index （AI） of the rats was scored. Meanwhile， HE ELISA， Western blot， and real-time quantitative PCR （RT-qPCR） were used to detect the effects of Rhodojaponin Ⅲ on TLR4/MyD88/NF-κB signal axis and RA. Results Rhodojaponin Ⅲ significantly reduced the AI scores of RA rats compared with model group （P<0.05） and it effectively inhibited the development of malignant hyperplasia and inflammatory cell infiltration into synovial tissue. Meanwhile， compared with model group， the expresson levels of the tumor necrosis facor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-17 （IL-17）， vascular endothelial growth factor （VEGF）， matrix metallopeptidase-2 （MMP-2）， matrix metallopeptidase-9 （MMP-9）， TLR4， MyD88， and phosphor-nuclear factor-kappa-B （p-NF-κB）/NF-κB were reduced in R-Ⅲ Lo， Mi， and Hi groups （P<0.05）. Compared with the TWG group， the levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， IL-17， VEGF， MMP-2， MMP-9， TLR4， MyD88， p-NF-κB/NF-κB factors increased in the R-Ⅲ Lo and R-Ⅲ Mi groups （P<0.05）， while no significant differences were observed in the R-Ⅲ Hi group （P>0.05）. Conclusion Rhodojaponin Ⅲ can improve RA by down-regulating the expression levels of TLR4， MyD88， and NF-κB. This paper offered a solid experimental foundation for the use of Rhodojaponin Ⅲ in the treatment of RA.

〔Keywords〕 Rhodojaponin Ⅲ; TLR4/MyD88/NF-κB signal axis; rheumatoid arthritis; Yangzhizhu [Rhododendron molle （Blum） G.Don]; inflammation; angiogenesis

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis， RA）是一种常见的自身免疫性疾病[1]。目前，全国有0.5%的人患有RA[2]。RA的主要特征有：滑膜炎、血管翳形成、邻近骨侵蚀、以及关节肿胀和疼痛等[3-6]。虽然多种抗风湿药物具有良好临床治疗效果，但RA患者与正常人仍相差了10～15年的预期寿命[7]。因此，我们需要进一步探索治疗RA的药物。

人体内各种炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-7、TNF-α等）能够促进炎症反应，加重邻近骨破坏，这表明炎症因子可能影响RA的发展[8-12]。有研究表明，阻断TNF-α、IL-1、IL-6和IL-7等炎症因子释放，可以减缓RA相关炎症反应[13-14]。TLR4能够接收外界刺激并将其转化为信号分子，从而传导相关炎症和免疫信号[15-16]。例如，TLR4通过依赖MyD88途径激活NF-κB信号[17]，促进TNF-α、IL-1、IL-7、IL-6等下游炎性因子的合成与分泌[18]，从而导致RA炎症和免疫反应发生[17-20]。多项研究表明，控制TLR4/MyD88/NF-κB信号轴有助于减轻RA症状[21-22]。因此，为缓解RA的发展，我们亟须探索阻断TLR4/MyD88/NF-κB信号轴的新药物。

羊踯躅Rhododendron molle （Blum） G.Don是中医用来治疗RA的常用药物，其提取物具有镇痛、消炎和免疫抑制的作用[23]。目前研究发现，羊踯躅中的主要活性成分之一闹羊花毒素Ⅲ具有抑炎作用，能够抑制TNF-α和IL-1β释放[24]。前期的研究报道了闹羊花毒素Ⅲ通过介导Wnt1/Dvl1/β-catenin信号通路来抑制滑膜细胞增殖和细胞炎症的产生，从而缓解RA[25]。而闹羊花毒素Ⅱ能抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号轴，抑制细胞炎症反应改善RA[26-27]。闹羊花毒素Ⅲ和Ⅱ均为羊踯躅的二萜类化合物，具有相似的化学结构[28]。因此，我们将进一步探讨闹羊花毒素Ⅲ是否也能通过TLR4/MyD88/NF-κB轴来改善RA。本研究拟通过研究闹羊花毒素Ⅲ对RA的调节作用，以期为闹羊花毒素Ⅲ临床治疗RA提供可靠的理论依据。

1 材料和方法

1.1  实验动物

48只Wistar雄性大鼠（200±20） g购自长沙市天勤生物技术有限公司。许可证号：SYXK（湘）2022-0007。实验伦理审批编号：LL2022061401。实验前先适应性饲养1周。

1.2  主要试剂及仪器

生物样品均质仪（杭州奥盛仪器有限公司，型号：BioPrep-24）;化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司，型号：ChemiScope6100）;荧光定量PCR仪（Thermo Fisher Scientific，型号：PIKOREAL96）。

闹羊花毒素Ⅲ（上海联迈生物工程有限公司，批号：LM20895）;雷公藤多苷片（贵州汉方药业有限公司，批号：2003006）;牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂购自美国Chondrex公司（批号分别为：20022和7001）;RIPA裂解液（长沙艾碧维生物科技有限公司，批号：AWB0136）;BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific，批号：23225）;TRIzon总RNA提取试剂盒和mRNA逆转录试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司（批号分别为：CW0580S和CW2569）;一抗VEGF、MMP-2、MMP-9、MyD88、p-NF-κB均购买自英国Abcam公司（批号分别为：ab32152、ab92536、ab76003、ab219413、ab76302）;TLR4抗体、核转录因子-κB（NF-κB）抗体、β-actin抗体、HRP goat anti-mouse IgG和HRP goat anti-rabbit IgG抗体以及IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α ELISA试剂盒均购自美国Proteintech公司（批号分别为：19811-1-AP、10745-1-AP、66009-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2、KE00021、KE10007、KE10020、KE10002）。

1.3  方法

1.3.1  Ⅱ型胶原诱导建立RA大鼠模型  RA大鼠模型采用Ⅱ型胶原诱导进行构建[27，29]。具体操作如下：将终浓度为2 mg/mL的牛Ⅱ型胶原溶液与完全弗氏佐剂以1∶1混合制成Ⅱ型胶原乳剂。于大鼠尾根部皮下注射300 μL制好的Ⅱ型胶原乳剂。7天后，同剂量二次注射Ⅱ型胶原乳剂。同时设置假手术组（Sham组），对该组大鼠注射等剂量生理盐水作为对照。每日观察大鼠关节肿胀情况。实验期间每4天根据关节肿胀程度评估关节炎指数（arthritis index， AI）。以AI作为判断RA大鼠模型构建成功与否的标准。AI评分每4天统计一次，根据关节肿胀程度进行评价。总共分为4个等级：未出现任何发红、肿胀状况，计为0分;趾关节出现轻微发红、肿胀状况，计为1分;趾或者足趾关节出现发红、肿胀状况，计为2分;除踝关节外，全部后肢关节出现发红、肿胀状况，计为3分;所有后肢关节出现发红、肿胀状况，计为4分[30]。由于前爪炎症的发生率很低，后足关节更容易出现严重肿胀，因此，选用两后肢之和來评价大鼠的发病机制[31]。所有关节肿胀评分之和即为AI值。当AI≥4时，RA大鼠模型构建成功[32]。

1.3.2  分组与给药  雷公藤疗法是当前治疗RA最有效和关键的疗法之一[33]。因此，本研究用雷公藤作为阳性对照药物。随机将48只Wistar雄性大鼠分成Sham组、RA模型组（Model组）、阳性药物雷公藤组[TWG组，50 mg·（kg·d）-1]、闹羊花毒素Ⅲ低剂量组[R-Ⅲ Lo组，0.06 mg·（kg·d）-1]、闹羊花毒素Ⅲ中剂量组[R-Ⅲ Mi组，0.12 mg·（kg·d）-1]、闹羊花毒素Ⅲ高剂量组[R-Ⅲ Hi组，0.24 mg·（kg·d）-1]，每组8只，灌胃给药。Sham组和Model组灌胃等剂量的生理盐水。28 d后，将大鼠麻醉，固定四肢，然后剪开腹壁，腹主动脉采血。最后，剪开皮肤，从邻近肌肉中分离踝关节，剪短两侧韧带，暴露滑膜位置，取出滑膜，并用于后续实验。

1.3.3  HE染色观察滑膜组织形态  用4%多聚甲醛固定大鼠踝关节滑膜组织。随后经石蜡包埋、切片、烘烤二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、苏木精和伊红染液染色、脱水、封片等过程，在光学显微镜下观察大鼠踝关节滑膜组织形态病变情况。

1.3.4  ELISA检测血清中促炎因子含量  取腹主动脉全血，在4 ℃下，1000×g离心15 min，取上层血清用于检测。分别按照试剂盒操作步骤，检测血清中促炎因子含量的变化。

1.3.5  Western blot检测血管生成、TLR4/MyD88/NF-κB轴相关蛋白  用RIPA裂解缓冲液提取大鼠踝关节滑膜组织中的总蛋白。再用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白质定量。随着SDS-PAGE电泳后，将总蛋白转移至硝化纤维素膜上。将膜与一抗4 ℃孵育过夜，再与二抗孵育90 min。内参蛋白为β-actin。最后，分析蛋白VEGF、MMP-2、MMP-9、TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB的相对表达量。

1.3.6  RT-qPCR检测TLR4/MyD88/NF-κB轴相关基因表达  按照试剂盒说明，用TRIzon试剂提取踝关节滑膜组织总RNA。然后，用紫外分光光度计测定260 nm与280 nm处的吸光度值，并计算其浓度跟纯度。再用mRNA反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA。接下来，将cDNA直接用于荧光定量PCR反应。运用Primer 5软件设计引物，结果见表1。最后，以β-actin为内参基因，用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。

1.4  统计学分析

本研究使用GraphPad Prism 9对实验数据进行评估。数据均用“x±s”表示。数据差异比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和多因素方差分析（two-way ANOVA）。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1  闹羊花毒素Ⅲ对RA大鼠的改善作用

首先，我们评估了不同时间点的AI评分变化。随着天数的变化，Sham组中AI评分无显著变化（P>0.05）。随着天数的变化，Model组AI评分逐渐升高，在第12天达到最高值（P<0.05），12 d以后无显著变化（P>0.05）。随着天数的变化，TWG、R-Ⅲ Lo组、R-Ⅲ Mi组、R-Ⅲ Hi组AI评分逐渐升高，在第12天 达到最高值，12 d以后AI评分逐渐降低（P>0.05）。此外，我们比较了不同组间的AI评分。在4 d后，Model组大鼠AI评分显著高于Sham组（P<0.05）。8 d后，TWG组、R-Ⅲ Mi组、R-Ⅲ Hi组与Model组比较，AI评分显著降低（P<0.05），且R-Ⅲ Hi组和TWG组AI评分基本一致（P>0.05）。见图1A。Sham组大鼠滑膜组织结构正常，表面光滑无增生;Model组、R-Ⅲ Lo组、R-Ⅲ Mi组大鼠滑膜组织增生，层次模糊，伴有大量炎性细胞浸润;TWG组、R-Ⅲ Hi组大鼠滑膜组织表面光滑，且层次清晰，见图1B。

2.2  闹羊花毒素Ⅲ抑制RA大鼠的炎症反应

如图2所示，相比于Sham组，Model组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17含量显著升高（P<0.05）。相比于Model组，R-Ⅲ Lo、R-Ⅲ Mi、R-Ⅲ Hi组中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17含量呈浓度依赖性降低（P<0.05）。与TWG组比较，R-Ⅲ Lo、R-Ⅲ Mi组中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17含量显著升高（P<0.05），而R-Ⅲ Hi组中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17含量无显著变化（P>0.05）。

2.3  闹羊花毒素Ⅲ抑制RA大鼠的血管生成

与Sham组相比，Model组中VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表达量显著升高（P<0.05）;TWG组、R-Ⅲ Lo组、R-Ⅲ Mi组、R-Ⅲ Hi组中VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平相比于Model组，呈剂量依赖性降低（P<0.05）。R-Ⅲ Lo组、R-Ⅲ Mi组中VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著升高于TWG组（P<0.05），而R-Ⅲ Hi组中VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平与TWG组无显著差异详见图3。

2.4  闹羊花毒素Ⅲ抑制RA大鼠的TLR4/MyD88/NF-κB信号轴激活

如圖4A所示，相较于Sham组，Model组中TLR4、MyD88、NF-κB基因的相对表达水平均显著上升（P<0.05）。R-Ⅲ Mi组、R-Ⅲ Hi组中TLR4、MyD88、NF-κB基因的相对表达水平相比于Model组，均显著降低（P<0.05）。而R-Ⅲ Lo组与Model组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。R-Ⅲ Lo组中TLR4、MyD88、NF-κB基因的相对表达水平显著高于TWG组（P<0.05）而R-Ⅲ Mi组、R-Ⅲ Hi组中TLR4、MyD88、NF-κB基因的相对表达水平与TWG组比，无显著性差异（P>0.05）。相比于Sham组，Model组中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达量显著增加（P<0.05）。R-Ⅲ Lo组、R-Ⅲ Mi组、R-Ⅲ Hi组中TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平相比于Model组，均呈浓度依赖性降低（P<0.05）。R-Ⅲ Lo组中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达量显著高于TWG组（P<0.05）而R-Ⅲ Mi组、R-Ⅲ Hi组中TLR4、MyD88、NF-κB基因的蛋白表达量与TWG组比，无显著性差异（P>0.05），见图4B。

3 討论

RA的发展与机体分泌的炎症因子[34]密切相关。例如，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等炎症因子的释放能够加重滑膜炎症反应[35]。本研究发现在RA造模后，大鼠AI评分显著增加，血清中促炎症因子表达水平显著上升。同时，在闹羊花毒素Ⅲ的干预下，大鼠血清中促炎因子的释放被抑制。这些结果表明，闹羊花毒素Ⅲ能够抑制促炎症因子的释放，产生抑炎作用。综上，闹羊花毒素Ⅲ可能是通过抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等的释放，缓解RA。

滑膜组织炎症和骨关节破坏的另一原因可能是血管生成[36]。研究表明VEGF能够调控血管生成，促进RA疾病发展[37]。同时，VEGF因子表达与RA患者病症也呈正相关的调控趋势，因此，可以选用VEGF检测RA病变程度[38-39]。基质金属蛋白酶（MMP），影响骨关节破坏，RA滑膜液中MMP-2和MMP-9[39]水平升高具有触发血管生成的能力[40-42]。本研究结果显示，RA大鼠中促血管因子（MMP-2、MMP-9和VEGF）表达量显著升高，闹羊花毒素Ⅲ的干预显著下调了RA大鼠促血管生成因子VEGF、MMP-2和MMP-9的表达。这些结果说明，闹羊花毒素Ⅲ可通过下调促血管生成因子（MMP-2、MMP-9和VEGF）的表达来改善RA。

TLR4-MyD88-NF-κB通路是常见于RA并调控相关炎性反应的信号通路[43]。TLR4蛋白监控先天免疫与后天免疫，并在RA患者中表达异常升高[44-45]。TLR4蛋白可以上调MyD88蛋白表达，促进NF-κB因子积累，进而诱导促炎因子的分泌，加剧RA滑膜炎症反应和骨破坏[46-49]。抑制该通路可以减缓相关炎性反应，从而改善RA[50]。本研究表明，在RA大鼠中，TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB等相关因子含量显著上升，且闹羊花毒素Ⅲ能显著抑制RA滑膜组织TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB等相关因子水平的上升。由此，我们得出，闹羊花毒素Ⅲ可以通过抑制TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB因子表达上调，减少促炎因子的分泌，抑制关节滑膜恶性增生，从而改善RA大鼠相关病症。这将为闹羊花毒素Ⅲ治疗RA提供实验基础。

综上所述，本研究表明闹羊花毒Ⅲ具有改善RA的作用。其主要作用机制可能是通过下调促血管生成相关因子（MMP-2、MMP-9和VEGF）和TLR4/MyD88/NF-κB信号轴相关蛋白的表达，抑制促炎因子诱导的炎症反应和抑制滑膜增生。

总之，闹羊花毒Ⅲ可通过调节TLR4/MyD88/NF-κB信号轴改善RA，这将为闹羊花毒素Ⅲ应用于RA的临床治疗提供可靠的实验依据。

参考文献

[1] EVANGELATOS G， FRAGOULIS G E， KOULOURI V， et al. MicroRNAs in rheumatoid arthritis： From pathogenesis to clinical impact[J]. Autoimmunity Reviews， 2019， 18（11）： 102391.

[2] ALETAHA D， SMOLEN J S. Diagnosis and management of rheumatoid arthritis： A review[J]. JAMA， 2018， 320（13）： 1360-1372.

[3] BI X， GUO X H， MO B Y， et al. LncRNA PICSAR promotes cell proliferation， migration and invasion of fibroblast-like synoviocytes by sponging miRNA-4701-5p in rheumatoid arthritis[J]. EBioMedicine， 2019， 50： 408-420.

[4] LIU H， ZHU Y L， GAO Y T， et al. NR1D1 modulates synovial inflammation and bone destruction in rheumatoid arthritis[J]. Cell Death & Disease， 2020， 11（2）： 129.

[5] RANA A K， LI Y， DANG Q J， et al. Monocytes in rheumatoid arthritis： Circulating precursors of macrophages and osteoclasts and， their heterogeneity and plasticity role in RA pathogenesis[J]. International Immunopharmacology， 2018， 65： 348-359.

[6] MATTHIJSSEN X M E， WOUTERS F， SIDHU N， et al. Tenosynovitis has a high sensitivity for early ACPA-positive and ACPA-negative RA： A large cross-sectional MRI study[J]. Annals of the Rheumatic Diseases， 2021， 80（8）： 974-980.

[7] VAN DEN HOEK J， BOSHUIZEN H C， ROORDA L D， et al. Mortality in patients with rheumatoid arthritis： A 15-year prospective cohort study[J]. Rheumatology International， 2017， 37（4）： 487-493.

[8] TAN Q， HUANG Q， MA Y L， et al. Potential roles of IL-1 subfamily members in glycolysis in disease[J]. Cytokine & Growth Factor Reviews， 2018， 44： 18-27.

[9] 许  艳， 崔海虹， 朱静媛. 金线莲苷对TNF-α诱导的人类风湿关节炎滑膜细胞增殖及炎症因子、MMPs产生的影响[J]. 湖北中医药大学学报， 2022， 24（2）： 38-42.

[10] YOKOTA K， SATO K， MIYAZAKI T， et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis[J]. Arthritis & Rheumatology， 2021， 73（7）： 1145-1154.

[11] AKRAM M， DANIYAL M， SULTANA S， et al. Traditional and modern management strategies for rheumatoid arthritis[J]. Clinica Chimica Acta， 2021， 512： 142-155.

[12] KOPER-LENKIEWICZ O M， SUTKOWSKA K， WAWRUSIEWICZ-KURYLONEK N， et al. Proinflammatory cytokines （IL-1， -6， -8， -15， -17， -18， -23， TNF-α） single nucleotide polymorphisms in rheumatoid arthritis-a literature review[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（4）： 2106.

[13] MALHOTRA H， GARG V， SINGH G. Biomarker approach towards rheumatoid arthritis treatment[J]. Current Rheumatology Reviews， 2021， 17（2）： 162-175.

[14] ALAM J， JANTAN I， BUKHARI S N A. Rheumatoid arthritis： Recent advances on its etiology， role of cytokines and pharmacotherapy[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2017， 92： 615-633.

[15] ARENAS-PADILLA M， MATA-HARO V. Regulation of TLR signaling pathways by microRNAs： Implications in inflammatory diseases[J]. Central-European Journal of Immunology， 2018， 43（4）： 482-489.

[16] QUERO L， TIADEN A N， HANSER E， et al. MiR-221-3p drives the shift of M2-macrophages to a pro-inflammatory function by suppressing JAK3/STAT3 activation[J]. Frontiers in Immunology， 2019， 10： 3087.

[17] WANG Q， ZHOU X， ZHAO Y J， et al. Polyphyllin I ameliorates collagen-induced arthritis by suppressing the inflammation response in macrophages through the NF-κB pathway[J]. Frontiers in Immunology， 2018， 9： 2091.

[18] ICHISE Y， SAEGUSA J， TANAKA-NATSUI S， et al. Soluble CD14 induces pro-inflammatory cytokines in rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells via toll-like receptor 4[J]. Cells， 2020， 9（7）： 1689.

[19] 袁  娟， 胡  玲， 宋小鴿， 等. 艾灸对类风湿性关节炎大鼠关节滑膜组织Toll样受体4-骨髓样分化因子88-核转录因子-κB信号通路的影响[J]. 针刺研究， 2015， 40（3）： 199-204.

[20] LI Y， XU J Z， GU C X， et al. Carvacrol suppresses inflammatory responses in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2019， 120（5）： 8169-8176.

[21] SAMARPITA S， KIM J Y， RASOOL M K， et al. Investigation of toll-like receptor （TLR） 4 inhibitor TAK-242 as a new potential anti-rheumatoid arthritis drug[J]. Arthritis Research & Therapy， 2020， 22（1）： 16.

[22] HEGEWALD A B， BREITWIESER K， OTTINGER S M， et al. Extracellular miR-574-5p induces osteoclast differentiation via TLR 7/8 in rheumatoid arthritis[J]. Frontiers in Immunology， 2020， 11： 585282.

[23] 姚禹民， 房  鑫， 李  俊， 等. 羊躑躅二萜类成分和各极性部位的体内外抗炎活性研究[J]. 上海中医药大学学报， 2019， 33（4）： 84-88.

[24] HE Y C， YAO Y M， XUE Q W， et al. Anti-rheumatoid arthritis potential of diterpenoid fraction derived from Rhododendron molle fruits[J]. Chinese Journal of Natural Medicines， 2021， 19（3）： 181-187.

[25] 刘笑蓉， 刘湘丹， 王  智， 等. 闹羊花毒素Ⅲ通过调控Wnt1/Dvl1/β-catenin通路影响成纤维样滑膜细胞增殖凋亡的实验研究[J]. 中国中西医结合杂志， 2022， 42（10）： 1199-1206.

[26] 阚玉娜， 谢佳明， 马立威， 等. 中药活性成分改善类风湿性关节炎作用机制研究进展[J]. 辽宁中医药大学学报， 2021， 23（10）： 139-145.

[27] KONG L L， WANG L F， ZHAO Q， et al. Rhodojaponin II inhibits TNF-α-induced inflammatory cytokine secretion in MH7A human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes[J]. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology， 2020， 34（10）： e22551.

[28] 夏德超， 杨天明， 朱景申， 等. 羊踯躅的研究进展[J]. 中药材， 2002， 25（11）： 829-832.

[29] HU X M， TANG J H， ZENG G， et al. RGS1 silencing inhibits the inflammatory response and angiogenesis in rheumatoid arthritis rats through the inactivation of Toll-like receptor signaling pathway[J]. Journal of Cellular Physiology， 2019， 234（11）： 20432-20442.

[30] DA SILVEIRA K L， DA SILVEIRA L L， THORSTENBERG M L， et al. Free and nanoencapsulated vitamin D3： Effects on E-NTPDase and E-ADA activities in an animal model with induced arthritis[J]. Cell Biochemistry and Function， 2016， 34（4）： 262-273.

[31] ZHANG Q， PENG W， WEI S， et al. Guizhi-Shaoyao-Zhimu decoction possesses anti-arthritic effects on type II collagen-induced arthritis in rats via suppression of inflammatory reactions， inhibition of invasion & migration and induction of apoptosis in synovial fibroblasts. Biomed Pharmacother， 2019， 118： 109367.

[32] HU X， TANG J， ZENG G， et al. RGS1 silencing inhibits the inflammatory response and angiogenesis in rheumatoid arthritis rats through the inactivation of Toll-like receptor signaling pathway. J Cell Physiol， 2019， 234（11）： 20432-20442.

[33] ZHANG Y Q， MAO X， LI W J， et al. Tripterygium wilfordii： An inspiring resource for rheumatoid arthritis treatment[J]. Medicinal Research Reviews， 2021， 41（3）： 1337-1374.

[34] SHEN P， LIN W J， BA X， et al. Quercetin-mediated SIRT1 activation attenuates collagen-induced mice arthritis[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2021， 279： 114213.

[35] FIGUS F A， PIGA M， AZZOLIN I， et al. Rheumatoid arthritis： Extra-articular manifestations and comorbidities[J]. Autoimmunity Reviews， 2021， 20（4）： 102776.

[36] CHEN Z， WANG H Q， XIA Y， et al. Therapeutic potential of mesenchymal cell-derived miRNA-150-5p-expressing exosomes in rheumatoid arthritis mediated by the modulation of MMP14 and VEGF[J]. Journal of Immunology， 2018， 201（8）： 2472-2482.

[37] DAI C Q， KUO S J， HU S L， et al. VEGF-C gene polymorphisms increase susceptibility to rheumatoid arthritis[J]. International Journal of Medical Sciences， 2019， 16（10）： 1397-1403.

[38] LEE Y H， BAE S C. Correlation between circulating VEGF levels and disease activity in rheumatoid arthritis： A meta-analysis[J]. Zeitschrift Für Rheumatologie， 2018， 77（3）： 240-248.

[39] MELINCOVICI C S， BO[S][5]CA A B， [S][5]U[S][5]MAN S， et al. Vascular endothelial growth factor （VEGF）-key factor in normal and pathological angiogenesis[J]. Revue Roumaine De Morphologie et Embryologie， 2018， 59（2）： 455-467.

[40] TATEMATSU N， WAGURI-NAGAYA Y， KAWAGUCHI Y， et al. Mithramycin has inhibitory effects on gliostatin and matrix metalloproteinase expression induced by gliostatin in rheumatoid fibroblast-like synoviocytes[J]. Modern Rheumatology， 2018， 28（3）： 495-505.

[41] DU H Y， ZHANG X， ZENG Y C， et al. A novel phytochemical， DIM， inhibits proliferation， migration， invasion and TNF-α induced inflammatory cytokine production of synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis patients by targeting MAPK and AKT/mTOR signal pathway[J]. Frontiers in Immunology， 2019， 10： 1620.

[42] DAS S， AMIN S A， JHA T. Inhibitors of gelatinases （MMP-2 and MMP-9） for the management of hematological malignancies[J]. European Journal of Medicinal Chemistry， 2021， 223： 113623.

[43] 井維尧， 杜小正， 田杰祥， 等. 基于TLR4/NF-KB通路的类风湿性关节炎滑膜炎症发病机制及中医药治疗研究进展[J]. 甘肃中医药大学学报， 2022， 39（2）： 84-89.

[44] BAHRAMI A， PARSAMANESH N， ATKIN S L， et al. Effect of statins on toll-like receptors： A new insight to pleiotropic effects[J]. Pharmacological Research， 2018， 135： 230-238.

[45] ZHANG Y D， JI T F， MA S， et al. MLL1 promotes migration and invasion of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis by activating the TRIF/NF-κB signaling pathway via H3K4me3 enrichment in the TLR4 promoter region[J]. International Immunopharmacology， 2020， 82： 106220.

[46] GOMES DA SILVA I I F， LIMA C A D， SILVA J E A， et al. Is there an inflammation role for MYD88 in rheumatoid arthritis？[J]. Inflammation， 2021， 44（3）： 1014-1022.

[47] MITCHELL J P， CARMODY R J. NF-κB and the transcriptional control of inflammation[M]//International Review of Cell and Molecular Biology. Amsterdam： Elsevier， 2018： 41-84.

[48] 李  梅， 蒋锦梅， 欧大明， 等. 白术多糖对类风湿性关节炎大鼠的抗炎作用及TLR4/NF-κB信号通路的影响[J]. 安徽医科大学学报， 2022， 57（4）： 552-557

[49] 张传英， 胡  玲， 蔡荣林， 等. 艾灸对类风湿性关节炎大鼠踝关节滑膜组织Toll样受体4/核因子-κB信号通路的影响[J]. 针刺研究， 2018， 43（11）： 687-691.

[50] 李宗祥， 肖  凯. 基于TLR4/NF-κB信号通路探讨通痹胶囊对胶原诱导型关节炎治疗机制的研究[J]. 中国免疫学杂志， 2019， 35（12）： 1453-1457.