支气管哮喘患儿微小RNA-21-5p的水平及临床意义

李 蕾,徐庆玲,吴玉芹

1.中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院儿科,云南昆明 650000;2.昆明同仁医院儿科,云南昆明 650228;3.昆明市儿童医院特需门诊,云南昆明 650228

支气管哮喘属于是一种慢性气道疾病,临床以气道慢性炎症反应为主要特征,临床表现为反复发作的喘息、胸闷及气急等[1-2]。流行病学调查结果表明[3]:我国成人哮喘发病率为1.24%,好发于具有哮喘家族史、有合并症、肥胖及吸烟人群中。既往研究表明[4]:支气管哮喘的发生多与免疫因素、炎症介质等有关,而辅助性T细胞1(Th1)/辅助性T细胞2(Th2)失衡与炎症介质密切相关。Th1能分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2),促使巨噬细胞活化,能调节机体免疫与炎症;而Th2细胞能分泌白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-13(IL-13),发挥促炎作用[5-6]。在正常人体中Th1/Th2处于动态平衡状态,但是当二者失衡后则能引起气道炎症疾病,增加支气管哮喘发生率。近年来,国外最新研究发现,微小RNA-21-5p(miR-21-5p)基因可能参与了肺损害气道高反应的病变过程,而且与慢性阻塞性肺疾病(COPD)有关[7]。而COPD与哮喘从病因、临床表现、治疗方法等相似,加强miR-21-5p在哮喘中的作用及表达,有助于指导临床诊疗,能为支气管哮喘治疗提供免疫治疗提供新的靶点[8]。因此,本研究以支气管哮喘患儿为对象,探讨支气管哮喘患儿miR-21-5p的水平及临床意义,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2019年6月至2021年6月就诊的支气管哮喘患儿155例纳入研究作为观察组,男89例,女66例;年龄6～12岁,平均(9.39±0.71)岁;体重6～51 kg,平均(28.57±3.41)kg;病程1～4年,平均(2.15±0.61)年;疾病严重程度:轻度76例,中度55例,重度24例;患儿均给予常规方法治疗,常规治疗3个月后,根据观察组患儿病情,进一步将患儿分为预后不良组(急性发作)和预后良好组。预后良好组的判断标准为临床缓解:日间几乎无咳嗽喘息或最多每周不超过1次轻微症状;夜间几乎无咳喘及憋醒或者最多每月不超过1次有轻度夜间症状;没有任何由哮喘导致的活动受限(可进行正常日常活动或运动,而不会诱发咳喘);几乎不用(或每周使用不超过1次)缓解症状的支气管舒张剂。另外,选取同期体检健康的儿童155例作为对照组,男86例,女69例;年龄6～13岁,平均(9.42±0.74)岁;体重7～50 kg,平均(29.41±3.43)kg。

1.2纳入和排除标准 纳入标准:(1)符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》中诊断标准[9];(2)年龄为6～13岁,而且均处于急性发作期;(3)均为初次入院病例,精神状态良好,能积极配合完成有关检查。排除标准:(1)精神异常、凝血功能异常或因肺炎等引起的喘息;(2)伴有肺间质性疾病、恶性肿瘤者;(3)近3个月内存在激素用药史、解痉平喘治疗史。

1.3仪器与试剂 高速离心机,型号:TG-16W,购于山东博科集团;荧光PCR板,型号:4729692001;96孔板,购于罗氏公司;紫外分光光度计,型号:U-T6A,购于上海屹谱仪器制造有限公司;恒温箱,型号:FLY-YS-430L,购于北京福意电器;引物购于上海生物工程设计院;酶联免疫吸附试验试剂盒购于罗氏公司;罗氏LightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR(qPCR)仪,购于Roche罗氏公司。

1.4方法

1.4.1miR-21-5p测定 观察组于入院后次日采集空腹肘静脉血3 mL,对照组于健康体检当天采集空腹肘静脉血3 mL。对采集的标本离心10 min,离心速度3 000 r/min,血清分离后置于低温下,备用。采用qPCR技术测定miR-21-5p,具体方法如下:取上述处理后的血液标本,采用Trizol法完成总RNA提取,紫外分光光度仪测定提取的RNA纯度,并完成总RNA纯度鉴定。待上述操作完毕后,完成逆转录:RNA模板14 μL、2 μL Enzymemix,4 μL 缓冲液,补充双蒸水至20 μL,在PCR检测仪上42 ℃下1 h、95 ℃下5 min,将合成的cDNA放置在-20 ℃冰箱中,保存。PCR反应体系:cDNA模板8 μL、SYBRP Green min 10 μL、PCR Primer mix 2 μL。设定反应条件:95 ℃下预变性10 min、95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,进行45个循环,每个血液标本重复3次,取Ct值。以β-actin作为内参,采用2-ΔΔCt法计算miR-21-5p相对表达水平,引物设计见表1[10-11]。

表1 引物设计

1.4.2嗜酸性粒细胞及炎症因子测定 取全血标本,采用XE-2100自动血液细胞分析仪测定嗜酸性粒细胞水平;采用酶联免疫吸附试验测定两组IL-4、IFN-γ,上述所有操作严格遵循仪器与试剂盒说明书完成[12-13],计算IFN-γ/IL-4。

2 结 果

2.1两组miR-21-5p水平及炎症指标比较 观察组支气管哮喘患儿miR-21-5p、IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒细胞水平高于对照组(P<0.05);IFN-γ/IL-4水平低于对照组(P<0.05),见表2。

表2 两组miR-21-5p及生化指标比较

2.2不同预后的支气管哮喘患儿miR-21-5p及炎症指标比较 155例支气管哮喘患儿经治疗后,预后良好131例,预后不良14例。预后良好组miR-21-5p、IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒细胞水平低于预后不良组(P<0.05);IFN-γ/IL-4高于预后不良组(P<0.05),见表3。

表3 两组miR-21-5p及炎症指标比较

2.3支气管哮喘患儿miR-21-5p水平的单因素分析 单因素分析表明:支气管哮喘患儿miR-21-5p水平与性别及体重无关(P>0.05);与病程、年龄及哮喘严重有关(P<0.05),见表4。

表4 支气管哮喘患儿miR-21-5p水平的单因素分析

2.4支气管哮喘患儿miR-21-5p水平的多因素Logistic回归分析 多因素回归分析表明:病程(β=1.846,OR=7.982,95%CI:6.313～8.493)、年龄(β=1.423,OR=6.791,95%CI:6.312～7.326)及严重程度(β=1.141,OR=5.457,95%CI:4.698～7.132)是支气管哮喘患儿miR-21-5p水平的影响因素,见表5。

表5 支气管哮喘患儿miR-21-5p水平的多因素Logistic回归分析

2.5支气管哮喘患儿miR-21-5p水平与炎症因子相关性及效能 Pearson相关性分析表明:支气管哮喘患儿miR-21-5p水平与IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒细胞呈正相关(r=0.673、0.716、0.636,P<0.05);与IFN-γ/IL-4呈负相关(r=-0.563,P<0.05);ROC曲线显示:miR-21-5p在支气管哮喘患儿中AUC值为0.851,诊断灵敏度为85.26%,特异度为80.18%,见表6和图1。

图1 miR-21-5p在支气管哮喘患儿中的效能ROC曲线

表6 支气管哮喘患儿miR-21-5p水平与炎症因子水平的相关性分析

3 讨 论

支气管哮喘好发于儿童,由肥大细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞等多种细胞因子共同参与的呼吸系统疾病,且多数患儿具有既往哮喘家族史[14]。既往研究表明[15]:支气管哮喘患儿中CD4+ T细胞发挥了重要的作用,能分化为Th1和Th2细胞亚群,二者失衡是支气管哮喘发生的重要原因。由此看出,支气管哮喘患儿发病后,常伴有明显的气道病理改变,临床多表现为支气管腺体肥大、气道平滑肌细胞增殖等,造成气道高反应[16]。本研究中,观察组miR-21-5p、IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒细胞水平高于对照组(P<0.05);IFN-γ/IL-4低于对照组(P<0.05);预后良好组miR-21-5p、IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒细胞水平低于预后不良组(P<0.05);IFN-γ/IL-4高于预后不良组(P<0.05)。本研究结果显示,支气管哮喘患儿常miR-21-5p水平异常,并伴有Th1和Th2细胞亚群失衡,其表达水平能预测患儿治疗预后。与IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒细胞水平相比,miR-21-5p检测具有以下优点:(1)由于Th1/Th2细胞失衡是支气管哮喘的发病机制之一,而miR-21-5p与免疫细胞的活化、增殖、分化及免疫应答有关,且miR-21-5p能通过多种途径参与哮喘的发生与发展,能更加准确的反映患儿疾病严重程度;(2)miR-21-5p测定过程中表达水平受到的影响因素较小,能减轻检测过程中存在的误差,可指导临床诊疗。

miR-21-5p属于一种高度保守的miRNA,从既往动物研究证实,miR-21-5p能参与调控细胞免疫及炎症状态,对于IL-4、IFN-γ等均具有调控作用[17]。由此看出,miR-21-5p能通过调控炎症因子水平,参与疾病的发生、发展。本研究中,单因素分析表明:支气管哮喘患儿miR-21-5p水平与病程、年龄及严重程度有关(P<0.05);Logistic多因素回归分析表明:病程(β=1.846,OR=7.982,95%CI:6.313～8.493)、年龄(β=1.423,OR=6.791,95%CI:6.312～7.326)及严重程度(β=1.141,OR=5.457,95%CI:4.698～7.132)是支气管哮喘患儿miR-21-5p水平的影响因素。本研究结果显示,支气管哮喘患儿miR-21-5p水平的影响因素较多,且不同因素间能相互作用及影响。(1)病程是影响支气管哮喘miR-21-5p水平的独立危险因素,对于病程相对较短的患儿,miR-21-5p水平相对较低,可能由于病程较短,能发挥机体免疫作用,发挥抗炎作用[18]。但是,随着病程延长机体免疫水平受损,导致Th1和Th2细胞亚群失衡加剧,造成机体内瀑布联级反应加重。(2)年龄也是影响支气管哮喘患儿miR-21-5p水平的独立危险因素,对于年龄较小患儿,身体免疫尚未全部形成,发病后炎症反应较为明显,能引起miR-21-5p水平持续升高[19]。(3)体重对于支气管哮喘miR-21-5p水平的影响存在争议,本研究中不同体重支气管哮喘患儿存在差异,可能与患儿体重越大,年龄越大,机体免疫水平升高,能抑制miR-21-5p水平,但是需进一步研究与探讨[20]。为了进一步分析支气管哮喘患儿与炎症因子的关系,本研究中对其进行相关性结果表明:支气管哮喘患儿miR-21-5p水平与IL-4、IFN-γ及嗜酸性粒细胞呈正相关正相关(r=0.673、0.716、0.636,P<0.05),与IFN-γ/IL-4水平呈负相关(r=-0.563,P<0.05)。ROC曲线分析表明:miR-21-5p用于支气管哮喘患儿诊断的AUC为0.851,灵敏度为85.26%,特异度为80.18%。本研究结果显示,miR-21-5p在支气管哮喘患儿中具有较高的诊断效能,能为临床诊疗提供参考依据。因此,支气管哮喘患儿应加强miR-21-5p水平测定,了解患儿疾病严重程度,指导患儿诊疗,以促进患儿早期恢复。

综上所述,支气管哮喘患儿miR-21-5p水平呈高表达,影响因素较多,而且与IL-4、IFN-γ及IFN-γ/IL-4水平存在相关性,能指导临床诊疗。