放射性药物联合免疫检查点抑制剂协同抗肿瘤研究新进展

曾馨莹，文雪君，郭志德，张现忠

1厦门大学公共卫生学院分子影像暨转化医学研究中心 分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室，福建厦门 361102 2中国医学科学院北京协和医院核医学科，北京 100730 3中国医学科学院临床医学研究所，北京 100730

近10年来，免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor，ICI)在肿瘤治疗领域取得了重大突破。2011年，第一个靶向细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4)的ICI伊匹单抗(Ipilimumab)获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于晚期黑色素瘤的治疗，此后多个靶向程序性死亡受体1及其配体(programmed death-1/ligand 1，PD-1/PD-L1)及淋巴细胞激活基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)的ICI陆续上市[1-2]。虽然ICI在多种转移性、难治性恶性肿瘤中获得了持久反应性，但患者对于ICI单药的响应率仅为20%～40%[3-4]。而ICI治疗产生的免疫相关不良事件及获得性耐药均可导致疾病进展[4]，因此，与其他治疗方式联合成为ICI治疗的新方向[2]。

研究表明，外照射放疗(external beam radiation therapy，EBRT)可引起肿瘤细胞DNA损伤、信号转导调节以及肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment，TIME)重塑[5]。EBRT通过均匀的低传能线密度(linear energy transfer，LET)射线，包括X射线及γ射线(0.2 keV/μm)，以高吸收剂量率(1～2 Gy/min)靶向照射部位[6]，导致肿瘤细胞DNA损伤，激活cGAS-STING-IRF3-Type Ⅰ干扰素(interferon，IFN)信号级联反应，招募调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)、髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)等免疫抑制细胞，诱导适应性免疫反应[7-8]，同时引起TIME中PD-L1表达上调，负性调节肿瘤浸润T细胞引起肿瘤耐药或复发[5，9]。因此，多个研究证明了EBRT与ICI的协同作用[10-11]。Twyman-Saint等[12]发现，PD-L1抗体的加入可逆转EBRT联合CTLA-4抗体引起的T细胞耗竭，增加黑色素瘤对联合治疗的响应率。然而EBRT作为一种局部治疗方式，即便通过免疫介导引起“远隔效应”，也仅有少数患者能因此获益[13-14]。

靶向放射性核素治疗(targeted radionuclide therapy，TRT)是一种内放射治疗，其中放射性药物通过全身给药特异性定位于靶点，向肿瘤传递细胞毒性辐射。TRT以低吸收剂量率(<1 Gy/h)长时间照射靶部位，射线的类型与放射性核素有关，包括α、β粒子及俄歇电子。LET及最大穿透深度也与核素衰变类型相关，α粒子具有较高的LET(50～230 keV/μm)和较小的穿透深度(50～100 μm)；β粒子则具有更低的LET(0.2 keV/μm)和几十至数百个细胞(mm级别)的穿透距离；俄歇电子的LET为4～25 keV/μm，组织穿透最大深度<1 μm[6]。因此，EBRT对于TIME的调节作用不能简单地外推至TRT[15-16]。研究发现，高剂量TRT诱导DNA双链断裂，可上调膜联蛋白A1及钙网蛋白[17]，激活Ⅰ型IFN，其幅度和时间过程与EBRT相当，而低剂量的TRT则表现出明显的免疫调节作用，包括促炎细胞因子及细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)的浸润[18-19]。然而，EBRT通过同源重组、非同源末端连接及碱基切除修复诱导DNA双链修复，TRT却通过跨损伤合成修复受损的DNA[20]。同时，Grzmil等[20]通过蛋白质组学研究发现，EBRT与TRT诱导了不同信号通路的激活，TRT主要影响表皮生长因子受体、丝裂原活化蛋白激酶、整合素和雌激素受体的信号转导。

本文将聚焦于该领域最新研究进展，对TRT联合PD-L1抗体治疗的模式及其机制进行综述，以期指导临床实践。

1 靶向治疗放射性药物联合ICI治疗

1.1 β核素放射性药物联合ICI治疗

1.1.1 碘[131I]

131I衰变发射β粒子及γ光子，是最早用于TRT的放射性核素。Rouanet等[17]比较了131I-ICF01012与ICI的不同组合方案，发现无论是否加入PD-1/PD-L1抗体，对于治疗效果均无显著影响，但观察到了TRT联合CTLA-4抗体后T细胞衰竭相关基因CD274、LAG3和Eomes增加。而131I-MnO2-BSA作为一种放射增敏剂，可改善肿瘤乏氧，诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，上调PD-L1的表达，抑制原发及转移瘤的生长[21]。

1.1.2 钇[90Y]

90Y具有纯β发射、能量强、半衰期短的特点，在Patel等[19]的研究中，发现中等剂量的EBRT与低剂量90Y-NM600(1.85 MBq)对于提高ICI疗效的作用是互补的。具体来说，联合治疗增加了总免疫细胞、CTLs、效应记忆T细胞(effector memory T cell，TEM)和γδ T细胞的数量，进而增加IFN-γ分泌，起到缓解肿瘤负担及减少自发转移的作用，联合中等剂量EBRT诱导远隔效应，可进一步缓解原发及转移瘤负担[19]。另有研究将此策略应用于Lewis肺癌模型治疗，仅用EBRT联合CTLA-4抗体治疗能够减少肿瘤转移，但在联合了90Y-NM600治疗后，能达到肿瘤完全缓解并诱导免疫记忆[22]。但Potluri等[23]研究发现，90Y-NM600联合PD-1抗体治疗对前列腺癌无效，其原因是PD-1抗体激活了Tregs，从而可导致免疫抑制。

1.1.3 镥[177Lu]

177Lu是最常用的TRT核素，其标记的探针177Lu-DOTATATE[24]和177Lu-PSMA-617[25]已获得美国FDA批准分别用于神经内分泌瘤及转移性去势抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC)。其中177Lu-DOTATATE联合纳武单抗(Nivolumab)的Ⅰ期临床试验证明了其安全性，在晚期神经内分泌肿瘤及广泛期小细胞肺癌中显示出抗肿瘤效果，总缓解率为14.3%(NCT03325816)[26]。177Lu-DOTATATE与伊匹单抗、纳武单抗联合使用在转移性Merkel细胞癌[27]、侵袭性垂体瘤患者[28]中能够安全且有效地缓解肿瘤进展。目前仍有几项177Lu-DOTATATE联合PD-1/PD-L1抗体治疗多种恶性肿瘤的临床试验(NCT04261855，NCT03457948，NCT05583708，NCT05142696，NCT04525638)正在进行中。

Prasad 等[29]在帕博利珠单抗(Pembrolizumab)或奥拉帕尼(olaparib)治疗无效的前列腺癌患者中，联合使用177Lu-PSMA-617治疗后前列腺特异性抗原水平趋于稳定。目前联合177Lu-PSMA-617及ICI用于mCRPC患者治疗的多项临床试验(NCT03805594，NCT03658447，NCT05150236)正在开展中。

Chen等[30]用177Lu-EB-RGD联合多剂量PD-L1抗体在鼠结直肠癌模型中诱导CD8+T细胞浸润，显著抑制了肿瘤生长，且提出TRT与ICI的给药时间窗对于治疗效果至关重要的观点。在此基础上，本研究团队进一步探索了177Lu-DOTA-EB-cRGDfK(177Lu-DER)联合治疗的给药策略，在体内外证明了放射性核素刺激后PD-L1表达呈时间及剂量依赖性上调，在TRT后4 h通过尾静脉注射PD-L1抗体能够大大提高联合治疗的疗效，联合治疗组小鼠血清促炎细胞因子、CTLs及CD4+辅助T细胞(helper T cells，Th1)浸润增加，肿瘤完全缓解并获得特异性免疫记忆效应[31]。随后用64Cu-DOTA-EB-cRGDfK(64Cu-DER)验证了该给药策略的有效性，提示该策略可推广至不同的放射性核素标记的探针中[32]。

此外，177Lu-DOTA-Folate[33]、177Lu-DOTA-Y003[34]、177Lu-h8C3[35]、177Lu-LLP2A[36]及177Lu-DNP-DOTA-BSA[37]联合ICI治疗均可抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠生存期。

1.2 α核素放射性药物联合ICI治疗

1.2.1 锕[225Ac]

由于α射线独特的优势，包括能量高、射程短、能够诱导DNA双链不可修复的断裂等[38]，α-TRT成为新的研究热点。与β-TRT相比，α-TRT剂量极低，225Ac-PSMA-617(30 kBq)联合PD-1抗体在RM1-PGLS模型中能够抑制肿瘤生长，达到部分完全缓解[39]。然而225Ac-DOTA-anti-PD-L1 Ab (14.8 kBq)联合PD-L1抗体(322 μg)同时给药却降低了小鼠的生存率[40]。

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1.2.2 砹[211At]

多聚ADP核糖聚合酶靶向的探针211At-MM4导致的DNA损伤，激活了先天免疫反应，CD4+、CD8+T细胞及巨噬细胞浸润增加，联合PD-1抗体治疗U87MG脑胶质瘤模型达到了完全缓解，65 d无进展[41]。Zhang等[42]开发的基于锰基纳米的放射免疫治疗促进剂211At-ATE-MnO2-BSA，联合了α-TRT、化学动力治疗及PD-L1抗体治疗。研究发现，211At-ATE-MnO2-BSA激活了树突状细胞(dendritic cells，DCs)，与PD-L1抗体联合使用可进一步增加CTLs、促炎细胞因子及 TEM浸润，有效抑制了肿瘤的生长、转移及复发[42]。

1.2.3 镭[223Ra]

二氯化镭(Xofigo，223RaCl2)经美国FDA批准已用于治疗mCRPC的骨转移，223Ra处理后促进了CTLs的杀伤作用，增加了主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ和钙网蛋白的表达[43]。在临床研究中发现，经223Ra治疗的患者免疫抑制性T细胞(表达TIM-3、PD-L1和PD-1)比例增加，同时Tregs及MDSC浸润增加，联合PD-L1抗体能够改善治疗效果[44-45]。在一项Ⅰb期临床研究(NCT02814669)中，评估了223Ra联合阿替利珠单抗(Atezolizumab)在mCRPC患者中的安全性和有效性，但联合治疗并未表现出更好的疗效，所有治疗组的中位总生存期为16.3个月，中位无进展生存期为3个月，但却增加了治疗相关毒性[46]。同时研究也发现产生治疗相关不良反应主要与阿替利珠单抗有关，因此目前正在进行的其他临床研究将Xofigo与帕博利珠单抗(NCT03996473)、纳武单抗(NCT04109729)或阿维单抗(NCT04071236)联合使用，用于晚期前列腺癌及非小细胞肺癌的骨转移治疗。

1.2.4 其他α核素

联合治疗的给药策略也是影响疗效的重要因素，剂量分割是提高EBRT联合ICI的常见方案，而对于α-TRT，一次给药效果优于多次给药。212Pb-VMT01联合CTLA-4及PD-1抗体治疗后，43%的肿瘤完全缓解，而接受多次给药方案的肿瘤最终发生进展[47]。

Nosanchuk等[48]则发现，基于213Bi的α-TRT与联合CTLA-4抗体的治疗效果无差异。213Bi的免疫调节作用依赖于损伤相关的分子模式(damage associa-ted molecular patterns，DAMPs)的释放并激活DCs，治疗后肿瘤组织Tregs下调，白细胞介素(interleukin，IL)-2、趋化因子C-C-基元配体 (chemokine C-C-motif ligand，CCL)-5及IFN-γ短暂上调，产生肿瘤杀伤作用[49-50]。

2 靶向诊断放射性药物联合ICI治疗

据文献报道，高剂量的经典诊断探针2-[18F]FDG (74-148 MBq)治疗可抑制肿瘤生长并适度延长生存期，提示诊断核素在肿瘤治疗中具有较大潜力[53-55]。如图1所示，本研究团队创新性地采用2-[18F]FDG联合PD-L1抗体治疗荷瘤小鼠，以静脉注射37 MBq或18.5 MBq 2-[18F]FDG后4 h联合400 μg PD-L1抗体治疗为一个疗程，两个疗程后(d0及d4)部分肿瘤完全缓解(5/8或4/8)，且治愈后再次接种肿瘤细胞未发现肿瘤生长[56]。进一步研究发现，联合治疗组小鼠脾脏内的TEM(CD8+/CD4+CD44highCD62Llow)维持在较高水平，提示小鼠有免疫记忆产生；在治疗过程中，血清中促炎细胞因子IFN-γ、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α及IL-6，TIME中Th1及CTLs于7 d内维持在较高水平，而单独2-[18F]FDG或PD-L1治疗组的细胞因子水平和CTLs水平轻度增高并于7 d内耗竭。Tregs(CD45+CD4+FOXP3+)、M2型巨噬细胞(CD206+F4/80+)及MDSC(CD45+CD11b+Gr-1+)仅在联合治疗组中下降，M1型巨噬细胞(iNOS+F4/80+)和DCs(CD80+CD86+)则显著上调。以上发现提示联合治疗对TIME的调控作用，相比于单独治疗组，联合治疗不仅更大程度地激活了小鼠的适应性免疫，还降低了免疫抑制性细胞水平，改善了免疫治疗的耐药性。

图1 2-[18F]FDG联合PD-L1 ICI治疗可显著延缓肿瘤生长，提高荷瘤小鼠总生存期

本课题组进一步探究了2-[18F]FDG的免疫调节作用，发现2-[18F]FDG在体外可导致DNA损伤，但仍保持复制及自我修复能力(图2A，2B)。同时，2-[18F]FDG通过激活NF-κB P65通路，与IRF3相互作用，促进PD-L1的转录，在体外呈时间及剂量依赖性上调；进一步研究发现，STAT1、STAT3和IRF1的敲低影响NF-κB P65的磷酸化(图2C，2D及图3)，因此PD-L1的上调也受STAT1/3-IRF1通路调控[56]。

图2 2-[18F]FDG诱导的PD-L1上调通过NF-κB/IRF3途径介导

图3 2-[18F]FDG诱导的PD-L1上调与经典STAT1/3-IRF1通路相关

本课题组亦探索了纯发射γ射线的核素99mTc标记的RGD对TIME的调节作用，发现同2-[18F]FDG一样，99mTc刺激PD-L1在多种肿瘤细胞系中上调。随后比较了不同联合治疗方案的疗效，发现18.5 MBq或37 MBq99mTc-RGD联合400 μg PD-L1抗体在4 h时间窗给药效果最佳，部分小鼠的肿瘤完全治愈(6/8)且90 d内无复发[57]。

3 小结与展望

总结近5年发表的放射性药物联合ICI协同抗肿瘤治疗的临床前研究发现，该类研究主要围绕治疗核素展开，包括经典的β核素(177Lu、90Y)以及α核素(211At、225Ac)等(表1)。TRT上调了PD-L1表达，增加CTLs及Th1细胞浸润，为后续ICI治疗提供了免疫原性微环境。联合治疗可进一步调控TIME，增加促炎细胞因子、TEM、M1巨噬细胞等浸润，下调Tregs及MDSC，有效抑制肿瘤生长，延长生存期，产生免疫记忆效应，部分研究甚至达到完全缓解。然而，也有研究指出，联合治疗未能正向调控TIME，未能提高TRT的疗效[23，35，48]。

表1 近5年发表的放射性药物联合ICI治疗的临床前研究

本团队既往研究发现，131I刺激了肿瘤细胞PD-L1表达呈时间及剂量依赖性上调[58]。故在此基础上，进一步选用β核素177Lu及64Cu进行探索，发现64Cu不仅可用于诊断，还具有治疗潜力[59]，用64Cu-DER联合PD-L1抗体的协同抗肿瘤治疗大大提升了64Cu-TRT的疗效[32]。此外，基于2-[18F]FDG的相关研究结果[53-55]，本研究团队发现，2-[18F]FDG诱导PD-L1的表达上调由NF-κB/IRF3和STAT1/3-IRF1信号通路介导，与DNA损伤通路激活有关，且放射性刺激与PD-L1抗体的给药时间窗对于治疗效果至关重要。在2-[18F]FDG刺激下，PD-L1上调需要一定时间，而18F半衰期短，难以长时间诱导PD-L1上调，因此4 h的时间窗最为合适[56]。

综上所述，诊断放射性药物联合PD-L1抗体的免疫治疗新范式可以调控TIME，显著提高疗效。与TRT相比，诊断放射性药物具有多种优势，包括可及性高，制备简单及血液毒性小等，如能将诊断性核素标记的PET/SPECT示踪剂应用于肿瘤联合治疗，将极大拓宽其应用范围，改善现有治疗性核素产量有限，特别是我国目前严重依赖进口的现状，拓展传统的肿瘤治疗模式。因此，未来研究中应进一步拓展诊断放射性药物联合免疫治疗的组合，探索不同核素对肿瘤细胞及微环境中其他细胞的影响，促进此种治疗新范式的临床转化。

作者贡献：曾馨莹、文雪君负责文献检索、 论文撰写及修订；郭志德、 张现忠负责论文选题和审校。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突