利用单转录本表达Cas9和sgRNA条件性编辑果蝇基因组

王秉政，张超，张佳丽，孙锦

研究报告

利用单转录本表达Cas9和sgRNA条件性编辑果蝇基因组

王秉政1，张超2，张佳丽2，孙锦1

1. 山东第一医科大学(山东省医学科学院)实验动物学院(省实验动物中心)，济南 250024 2. 山东第一医科大学(山东省医学科学院)临床与基础医学院(基础医学研究所)，济南 250024

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)系统具有高效、简单、易编辑等特性，在基因工程方面具有巨大潜能。在果蝇()基因功能研究中，CRISPR/Cas9系统也得到了广泛应用。然而利用传统的CRISPR/Cas9系统编辑果蝇基因时，Cas9与sgRNA表达元件往往分别存在于不同果蝇中，需要通过复杂的遗传杂交过程将Cas9与sgRNA整合到一个个体中，操作周期长且较为复杂。本研究在CRISPR/Cas9系统基础上引入tRNA-sgRNA系统和triplex元件，利用triplex元件连接Cas9和tRNA-sgRNA基因，稳定单转录本切割后Cas9 mRNA的末端，实现一个转录本可以同时表达Cas9蛋白和sgRNA，通过一次杂交即可得到相应表型的后代，简化了遗传操作过程。本研究利用这一新的条件性基因编辑系统，分别对果蝇眼部()基因和翅成虫盘()基因进行条件性敲除，观察到与预期相符的对应表型。因此，该条件性基因编辑系统在高效性、可扩展性和易操作性等方面是对现有CRISPR/Cas9系统进行的重大改进。

CRISPR/Cas9；tRNA-sgRNA；triplex元件；条件性基因编辑；果蝇

基因编辑(genome editing，GE)是生物学研究中不可或缺的技术[1]，高效的基因编辑是通过断裂目标染色体序列的DNA双链从而诱导DNA损伤修复实现的。CRISPR/Cas9(clustered regularly inter­spaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9)是一种对靶向基因进行特定DNA修饰的基因编辑技术，具有高效性、简便性、准确性等优势，在基因编辑领域得到广泛应用[2～5]。CRISPR/Cas9技术利用一段与靶序列互补的gRNA引导Cas9核酸酶对特异靶向DNA进行识别和切割，造成DNA的双链断裂，细胞会利用自身具备的两种DNA修复机制对断裂的DNA进行修复。细胞主要采取非同源末端连接机制(nonhomologous end joining，NHEJ)修复受损的DNA。但NHEJ修复错误率极高，易造成碱基的缺失或插入，导致移码突变，使基因功能丧失[6]。

在常见的CRISPR/Cas9基因编辑技术中，Cas9酶和sgRNA往往由不同的启动子元件驱动表达，操作复杂，周期较长。tRNA-sgRNA系统利用果蝇体内的tRNA加工机制，从单个RNA聚合酶II或III转录本中产生多个sgRNA，可以使一个启动子同时表达包含Cas9酶和sgRNA阵列的单一转录本，显著提高了果蝇中CRISPR/Cas9系统的编辑效率和特异性[7]。但在tRNA-sgRNA系统中，mRNA经过加工释放sgRNA后会缺失3′UTR的poly(A)结构，易被细胞内的3′→5′核酸外切酶识别并切割，不利于Cas9的表达。Wilusz等[8,9]在基因中发现，尽管缺乏poly(A)，但三螺旋结构(triplex)的存在使转录产物在体内能够被有效翻译。所以，triplex元件的引入能够保证Cas9的正确表达。

果蝇眼睛颜色是由眼部色素细胞中的红色素和褐色素合成、沉积形成的，由位于X染色体的()基因决定。基因突变导致眼部色素细胞中两种眼色素缺乏，产生果蝇白眼突变表型，此突变表型易于观察。翅成虫盘是果蝇中经典的基因表达模型，成对存在，可以分为前隔室(anterior compartment)和后隔室(posterior compartment)两部分。()基因是翅成虫盘中表达的重要基因之一，位于果蝇X染色体内。

本研究以果蝇为材料，利用CRISPR/Cas9系统、tRNA-sgRNA系统以及triplex元件，构建了一种条件性基因编辑系统，实现单转录本同时表达Cas9和sgRNA。本研究利用该系统，对决定果蝇眼部颜色的基因和翅成虫盘中表达的基因进行编辑，成功验证了其高效性、便捷性。这一新的条件性基因编辑系统，为条件性编辑果蝇基因组提供了更多选择。

1 材料与方法

1.1 果蝇品系及饲养

本研究注射用果蝇基因型为y[1]sc[1]v[1]P{y[+t7.7]=nos-phiC31int.NLS}X;P{y[+t7.7]=CaryP}attP40，在标准玉米粉/糖/琼脂培养基上培养，温度为25℃，湿度为60%。en-Gal4品系果蝇、ey-Gal4品系果蝇、gRNA单独表达系统品系果蝇均来自清华大学果蝇中心。果蝇注射由清华大学果蝇中心完成。

1.2 引物设计

按照本研究质粒构建思路，在Flybase数据库中查询基因、基因序列信息。依照CRISPR/Cas9靶点设计原则，引物序列见表1。

1.3 转基因果蝇基因型鉴定

用CO2麻醉转基因果蝇，取一只置于1.5 mL 离心管中，放于冰上。加入50 μL SB buffer和1 μL Proteinase K，研磨棒充分研磨。快速离心，37℃水浴锅消化60 min。消化结束后，12,000 r/min 离心2 min，取10 μL上清液于PCR排管中。置于PCR仪中，设定程序95℃ 3 min。结束后配置反应体系，PCR反应体系为：2×EsMasterMix(Dye) 25 µL，Dmt-Fs 1 µL，ftz 2 µL，果蝇基因组DNA 2 µL，加 ddH2O 至总体积为 50 µL。PCR程序设定循环次数为35次，反应条件：95℃预变性 3 min；95℃变性 20 s，55℃退火 30 s，72℃延伸1 min；最后再72℃延伸3 min。

1.4 翅成虫盘免疫荧光染色

基因具有多种剪切产物，会产生对应的多种蛋白。Br-C(美国DSHB公司，货号：25E9.D7)是能够识别所有基因相关蛋白产物的抗体，可用于翅成虫盘免疫荧光染色。在1.5 mL离心管中加入1 mL含10% BSA的PBS溶液，置于冰上，解剖出3龄幼虫晚期的一对翅成虫盘及周边非脂肪组织，放于离心管中。去掉上清，加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，固定30 min。吸去上清，加1 mL含0.1% Triton-100的PBS溶液(以下简称为0.1%PBST)，摇床慢摇，15 min，重复4次。吸去上清，配制5%封闭液(950 μL 0.1%PBST + 50 μL山羊血清)，加入1 mL 5%封闭液，摇床慢摇1 h。吸去上清，加入200 μL一抗(Br-C，用0.1%PBST 1∶10稀释)，锡箔纸包裹避光，4℃摇床过夜。吸去上清，加1 mL 0.1%PBST，摇床慢摇15 min，重复3次。吸去上清，加入300 μL二抗(594 anti-mouse，300 μL 0.1%PBST + 1滴)，用锡纸包裹，摇床慢摇2.5 h。直接加入DAPI，稀释比例1∶1000，摇床慢摇10 min。吸去上清，加1 mL 0.1%PBST，摇床慢摇15 min，重复4次。将完整独立的翅成虫盘从组织中解剖出来，放入滴有Fluoromount™ Aqueous Mounting的载玻片上，盖上盖玻片封固，完成样品铺片。

表1 引物序列信息

1.5 条件性敲除系统的构建

以质粒nos-cas9[10]为模板，通过PCR扩增得到Cas9蛋白编码序列，其中所用的引物分别为cas9-F、cas9-R(序列见表1)。质粒pNP[11]经过I和I酶切回收，与PCR扩增得到的Cas9蛋白编码序列通过同源重组的方式连接，产物转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，测序正确的质粒记为UAS-Cas9。triplex与tRNA-sgRNA序列由苏州金唯智公司合成，具体序列见图1。

利用引物Triplex-F、tRNA-sgRNA-R(序列见表1)，通过PCR扩增得到triplex与tRNA-sgRNA序列。PCR产物经回收后与经过I和II酶切回收的UAS-Cas9质粒进行同源重组连接，产物转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆，测序正确的质粒标记为UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA，含有以下表达元件(图2)：triplex元件为一个稳定的三级RNA结构，位于Cas9蛋白表达元件下游；tRNA-sgRNA元件上含有1段果蝇tRNA编码序列(深绿色)、1段带有两个I位点的间隔区(红色)、gRNA骨架序列(紫色)和水稻tRNA编码序列(黄色)，其位于triplex表达元件下游。

图1 triplex与tRNA-sgRNA碱基序列

绿色标注区域为triplex序列，共110个碱基对；蓝色标注区域为tRNA-sgRNA序列，共269个碱基对。triplex序列位于tRNA-sgRNA序列上游。

图2 基因编辑系统元件示意图

1.6 针对决定眼睛颜色w基因的转基因果蝇构建

将sgRNA设计在基因的第1个外显子起始密码子ATG的后面，在缺失1～2个碱基的情况下便会产生大量氨基酸编码的错位(移码突变)，影响蛋白质的生物学功能。所用到的引物为White-F和White-R (序列见表1)，将退火形成的双链DNA产物插入到经I酶切回收的UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA质粒中，得到UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA质粒。通过显微注射的方式分别将空质粒和sgRNA质粒注射到基因型为y[1]sc[1]v[1]P{y[+t7.7]=nos- phiC31int.NLS}X;P{y[+t7.7]=CaryP}attP40的果蝇胚胎中，25℃培养，并通过遗传整合的方式最终得到纯合的转基因果蝇(分别标记为Cas9,sgRNA和Cas9,sgRNA)。

1.7 针对果蝇翅成虫盘br基因的转基因果蝇构建

基因DNA序列编码区全长为9822 bp，由7个外显子和4个内含子组成。sgRNA在基因位点上设计的位置是以第1外显子作为突变区域设计靶点，在起始密码子ATG后进行移码突变，影响原有蛋白的生物学功能，得到基因的突变体。基因转录本设计如图3所示。

以br-sg-F、br-sg-R(序列见表1)为引物，以UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA为模板，将PCR回收产物插入到经I酶切回收的UAS-Cas9- triplex-tRNA-sgRNA质粒中，得到UAS-Cas9-triplex- tRNA-sgRNA质粒。

图3 sgRNA靶标位点示意图

白色方框表示UTR；黑色线段表示内含子；黑色方框表示外显子；与竖线相连的黑色方框为基因转录本的第1外显子，折线上方为第1个外显子全部序列，ATG为起始密码子，带下划线的大写字母为sgRNA靶位点序列。

通过显微注射的方式将上一步得到的UAS- Cas9-triplex-tRNA-sgRNA质粒注射到基因型为y[1]sc[1]v[1]P{y[+t7.7]=nos-phiC31int.NLS}X;P{y[+t7.7]=CaryP}attP40的果蝇胚胎中，25℃培养，并通过遗传整合的方式最终得到纯合的转基因果蝇。随机提取两只转基因果蝇DNA，以其为模板，用引物Dmt-Fs、ftz(序列见表1)进行基因型鉴定，目的条带大小均应为630 bp。利用琼脂糖凝胶电泳法检验目的条带，大小与预期一致(图4)。

2 结果与分析

2.1 针对w基因的条件性敲除

为验证UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA系统的编辑效率，本研究以决定眼睛颜色的基因为例，构建了条件性敲除基因的转基因果蝇。用ey-Gal4果蝇作为母本与纯合的转基因果蝇杂交，25℃培养，使杂交后代在眼睛中特异性表达Cas9和sgRNA。取孵化后3～5天的子代雌性成虫观察表型，结果如图5A所示。ey-Gal4果蝇与Cas9,sgRNA果蝇杂交得到的后代ey-Gal4>Cas9,sgRNA作为对照组，对照组雌性果蝇眼睛表型为野生型(wild type，WT)的深红色。以ey-Gal4果蝇与条件性敲除基因果蝇杂交得到的后代ey-Gal4>Cas9,sgRNA为实验组，共出现3种代表性表型，记为Class 1、Class 2、Class 3。杂交后代因不同数量的眼睛色素细胞中基因被编辑出现不同程度的眼睛颜色改变，当基因只有一个拷贝被编辑时，色素细胞颜色会变浅为浅红色，当基因的两个拷贝都被编辑时，色素细胞变为白色。利用ImageJ软件，对眼睛色块面积进行统计：Class 1为整个眼睛全为白色的表型，说明整个眼睛所有色素细胞中基因的两个拷贝都被有效编辑；Class 2为眼睛白色面积占比超过90% 且剩余部分为浅红色的表型，说明绝大部分色素细胞中基因的两个拷贝都被有效编辑，剩余的少部分色素细胞中基因的两个拷贝至少有一个被编辑；Class 3为眼睛白色面积占比超过50% 且剩余部分为浅红色的表型。从对照组和实验组的杂交后代中各取34只雌性果蝇进行统计，Class 1所占比例为10.3%，Class 2所占比例为55.9%，Class 3所占比例为33.8% (图5B)。Class 1和Class 2共占比例为66.2%，说明大部分雌性果蝇眼睛色素细胞中基因的两个拷贝都被有效编辑。实验组雌性果蝇的眼睛形态和对照组相比没有明显变化，只有眼睛颜色发生变化，表明眼睛发育没有受到影响。结果证明了此系统不仅可以高效的条件性敲除基因，而且特异性强。

图4 br转基因果蝇鉴定

M：D15000+2000 marker；1、2：转基因果蝇PCR扩增条带。

为了比较UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA系统和传统gRNA单独表达系统的编辑效率，本研究同样用ey-Gal4果蝇作为母本与gRNA单独表达果蝇品系杂交，25℃培养。该gRNA单独表达果蝇品系中，Cas9的表达同样由UAS调控，但是sgRNA的表达由U6b启动子控制，而且该sgRNA的序列与本研究使用的UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA系统中的相同。同样取3～5天子代雌性成虫观察表型，结果出现了与新系统不同的表型(图5A)，新出现的两种表型分别标记为Class 4和Class 5。Class 4为眼睛白色面积占比超过50%，而剩余部分为深红色的表型，说明部分色素细胞中基因的两个拷贝都未被有效编辑；Class 5为眼睛为深红色面积比例超过85%的表型，说明近90%的色素细胞中基因的两个拷贝都未被有效编辑。同样从传统gRNA单独表达系统的实验组杂交后代中取34只雌性果蝇进行统计，结果如图5B所示。Class 1所占比例为2.9%，Class 2所占比例为16.3%，Class 3所占比例为23.5%，Class 4所占比例为42.6%，Class 5所占比例为14.7%。其中Class 1和Class 2共占比例仅为19.2%，远低于UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA系统超过60%的比例。而且UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA系统敲除基因后，白色部分以外的眼睛颜色多为浅红色，如Class 2、Class 3，而在传统gRNA单独表达系统中，白色部分以外的眼睛颜色仍多为深红色，说明这部分果蝇眼睛色素细胞中基因的两个拷贝都未被编辑。以上结果表明，UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA系统与传统gRNA单独表达系统相比，具有更高的基因编辑效率。

2.2 针对br基因的条件性敲除

本研究构建的UAS-Cas9-triplex-tRNA-sgRNA质粒含有两个sgRNA，即sgRNA 1和sgRNA 2，经过测序，结果见图6。

图5 条件性敲除w基因的果蝇眼睛表型及统计图

A：果蝇眼睛颜色表型图。以ey-Gal4>Cas9,sgRNA果蝇作为对照组，眼睛表型颜色为野生型的深红色(WT)。Class 1、Class 2、Class 3、Class 4、Class 5为实验组中出现的5种雌性果蝇眼部表型。B：雌性果蝇眼睛不同表型统计与占比分析图。

图6 br基因sgRNA碱基序列测序图

图中蓝色标注的区域为目标碱基序列，与其下方相对应的是序列及峰图。

除了对基因进行条件性编辑验证这一系统的高效性外，本研究还对果蝇翅成虫盘中基因进行条件性编辑，以此进一步验证该系统的编辑效率。en-Gal4果蝇是特异性在翅成虫盘后隔室表达的常用品系，前隔室的细胞可以作为后隔室的内在对照。利用en-Gal4,UAS-GFP果蝇品系作为母本分别与野生型果蝇和条件性敲除基因果蝇品系进行杂交，以野生型杂交子代作为对照。从实验组和对照组的杂交后代中分别随机选取30只处于晚期的雄性3龄幼虫，共60个翅成虫盘，进行翅成虫盘解剖和荧光染色，观察Br蛋白在翅成虫盘中表达情况(图7)。a与a′为Br蛋白在对照翅成虫盘中的荧光染色图，结果显示Br蛋白在整个翅成虫盘都有分布，且在前隔室和后隔室细胞中的表达量相同。b与b′为基因在翅成虫盘中被条件性敲除后的荧光染色图。两组染色结果的对比表明，基因被条件性编辑后，在翅成虫盘中GFP绿色荧光区域没有正常表达。所取的60个雄性翅成虫盘中，基因被成功敲除的共44个，占比为73.33%，证明此系统可以高效的条件性敲除在翅成虫盘中表达的基因。

3 讨论

人类基因组计划对科学的影响不可估量。从第一代DNA核酸酶编辑系统(zinc finger nuclease，ZFN)、第二代(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)到第三代CRISPR/Cas9系统，基因编辑效率不断提高、成本也逐渐降低，应用范围不断扩大[7]。条件性基因敲除(conditional knoc­kout，cKO)克服了基因完全敲除导致胚胎死亡或早亡的缺点[12]，可用于研究基因在特定发育阶段或特定组织中的功能[13]。

果蝇作为经典模式生物，具有清晰的遗传背景和简便的遗传实验操作，在遗传学、发育生物学、生物化学以及分子生物学等多个领域占有举足轻重的地位。条件性敲除在果蝇中也得到了广泛应用，最初常用的条件性敲除方式为噬菌体Cre/loxP[14]和酵母FLP/FRT[15,16]位点特异性重组酶系统，均能在果蝇体内发挥作用[17]。但Cre/loxP被证实在果蝇体内效率较低[18]，且对果蝇有一定的毒性[19]。FLP/FRT虽然能在果蝇中高效介导基因重组[16]，但并不适用于胚胎早期阶段[20,21]。

目前在果蝇中使用最普遍的基因编辑方法是Charpentier等[22]提出的CRISPR/Cas9系统。该系统由一个包含独特间隔序列的CRISPR-RNA (crRNA)和一个CRISPR-Cas核酸酶组成。利用生殖细胞稳定表达Cas9的转基因果蝇品系，可实现高效可遗传的DNA定点突变。但Cas9酶和sgRNA由不同的启动子元件驱动，操作复杂并且周期较长。Ding等[23]报道了一种在水稻(L)中将gRNA融合进Cas9或Cpf1蛋白内含子中的单转录本Cas系统，提高了基因组编辑的效率和能力。本研究所构建的方法在果蝇中同样实现了在单转录本同时表达Cas9与sgRNA。

图7 在翅成虫盘中高效敲除br基因

a图为对照组翅成虫盘中的分布，基因型为en-Gal4>UAS-GFP；a′为a的Br-C染色通道；b图为实验组基因被条件性敲除后雄性翅成虫盘中的分布，基因型为en-Gal4>Cas9，sgRNA；b′为b的Br-C染色通道。GFP绿色荧光为Gal4的表达区域。标尺=50 μm。

本研究以果蝇为实验材料，在CRISPR/Cas9系统基础上，引入tRNA-sgRNA系统以及triplex元件，构建了高效的条件性基因编辑系统。首先针对果蝇眼部基因进行条件性敲除并观察表型，其次运用UAS/Gal4系统对翅成虫盘中基因进行条件性敲除，通过免疫荧光染色观察蛋白表达。通过这两项基因编辑实验，验证了该基因编辑系统的稳定性、高效性和简便性。

针对基因进行编辑的实验结果显示，本研究构建的单转录本表达Cas9和sgRNA系统，比传统的CRISPR/Cas9条件性基因编辑系统效率更高。传统的CRISPR/Cas9条件性基因编辑系统中，Cas9由UAS调控转录，转录的mRNA 3′端是Poly(A)结构，sgRNA由U6b启动子驱动表达。本研究新构建的单转录本表达Cas9和sgRNA系统中，Cas9和sgRNA的表达是由同一个UAS元件调控，得到的Cas9 mRNA的3′端是triplex结构。因此编辑效率的不同也许是由于Cas9蛋白或sgRNA表达量的不同导致的，未来可以针对这一方面进行深入探索。

综上所述，利用单转录本表达Cas9和sgRNA条件性编辑果蝇基因组系统，为果蝇基因组的精确编辑提供了更多选择。

[1] Carroll D. Genome editing: past, present, and future., 2017, 90(4): 653–659.

[2] Tyagi S, Kumar R, Das A, Won SY, Shukla P. CRISPR- Cas9 system: a genome-editing tool with endless possi­bilities., 2020, 319: 36–53.

[3] Cong L, Ran FA, Cox D, Lin SL, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu XB, Jiang WY, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems., 2013, 339(6121): 819–823.

[4] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity., 2012, 337(6096): 816–821.

[5] Mali P, Yang LH, Esvelt KM, Aach J, Guell M, Dicarlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-guided human genome engineering via Cas9., 2013, 339(6121): 823–826.

[6] Gratz SJ, Ukken FP, Rubinstein CD, Thiede G, Donohue LK, Cummings AM, O'connor-Giles KM. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in., 2014, 196(4): 961–971.

[7] Ren YX, Xiao RD, Lou XM, Fang XD. Research advance and application in the gene therapy of gene editing technologies., 2019, 41(1): 18–27.任云晓, 肖茹丹, 娄晓敏, 方向东. 基因编辑技术及其在基因治疗中的应用. 遗传, 2019, 41(1): 18–27.

[8] Wilusz JE, Jnbaptiste CK, Lu LY, Kuhn CD, Joshua-Tor L, Sharp PA. A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails., 2012, 26(21): 2392–2407.

[9] Campa CC, Weisbach NR, Santinha AJ, Incarnato D, Platt RJ. Multiplexed genome engineering by Cas12a and CRISPR arrays encoded on single transcripts., 2019, 16(9): 887–893.

[10] Ren XJ, Sun J, Housden BE, Hu YH, Roesel C, Lin SL, Liu LP, Yang ZH, Mao DC, Sun LZ, Wu QJ, Ji JY, Xi JZ, Mohr SE, Xu J, Perrimon N, Ni JQ. Optimized gene editing technology forusing germ line-specific Cas9., 2013, 110(47): 19012–19017.

[11] Qiao HH, Wang F, Xu RG, Sun J, Zhu RB, Mao DC, Ren XJ, Wang X, Jia Y, Peng P, Shen D, Liu LP, Chang ZJ, Wang GR, Li S, Ji JY, Liu QF, Ni JQ. An efficient and multiple target transgenic RNAi technique with low toxicity in., 2018, 9(1): 4160.

[12] Gurumurthy CB, O'brien AR, Quadros RM, Adams J, Alcaide P, Ayabe S, Ballard J, Batra SK, Beauchamp MC, Becker KA, Bernas G, Brough D, Carrillo-Salinas F, Chan W, Chen HY, Dawson R, Demambro V, D'hont J, Dibb KM, Eudy JD, Gan L, Gao J, Gonzales A, Guntur AR, Guo HP, Harms DW, Harrington A, Hentges KE, Humphreys N, Imai S, Ishii H, Iwama M, Jonasch E, Karolak M, Keavney B, Khin NC, Konno M, Kotani Y, Kunihiro Y, Lakshmanan I, Larochelle C, Lawrence CB, Li L, Lindner V, Liu XD, Lopez-Castejon G, Loudon A, Lowe J, Jerome-Majewska LA, Matsusaka T, Miura H, Miyasaka Y, Morpurgo B, Motyl K, Nabeshima YI, Nakade K, Nakashiba T, Nakashima K, Obata Y, Ogiwara S, Ouellet M, Oxburgh L, Piltz S, Pinz I, Ponnusamy MP, Ray D, Redder RJ, Rosen CJ, Ross N, Ruhe MT, Ryzhova L, Salvador AM, Alam SS, Sedlacek R, Sharma K, Smith C, Staes K, Starrs L, Sugiyama F, Takahashi S, Tanaka T, Trafford AW, Uno Y, Vanhoutte L, Vanrockeghem F, Willis BJ, Wright CS, Yamauchi Y, Yi X, Yoshimi K, Zhang XS, Zhang Y, Ohtsuka M, Das S, Garry DJ, Hochepied T, Thomas P, Parker-Thornburg J, Adamson AD, Yoshiki A, Schmouth JF, Golovko A, Thompson WR, Lloyd KCK, Wood JA, Cowan M, Mashimo T, Mizuno S, Zhu H, Kasparek P, Liaw L, Miano JM, Burgio G. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation., 2019, 20(1): 171.

[13] Jin M, Eblimit A, Pulikkathara M, Corr S, Chen R, Mardon G. Conditional knockout of retinal determination genes in differentiating cells in., 2016, 283(15): 2754–2766.

[14] Hamilton DL, Abremski K. Site-specific recombination by the bacteriophage P1 lox-Cre system. Cre-mediated synapsis of two lox sites., 1984, 178(2): 481–486.

[15] Andrews BJ, Proteau GA, Beatty LG, Sadowski PD. The FLP recombinase of the 2 micron circle DNA of yeast: interaction with its target sequences., 1985, 40(4): 795–803.

[16] Golic KG, Lindquist S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in thegenome., 1989, 59(3): 499–509.

[17] Germani F, Bergantinos C, Johnston LA. Mosaic analysis in., 2018, 208(2): 473–490.

[18] Siegal ML, Hartl DL. Transgene coplacement and high efficiency site-specific recombination with the Cre/loxP system in., 1996, 144(2): 715–726.

[19] Heidmann D, Lehner CF. Reduction of Cre recombinase toxicity in proliferatingcells by estrogen- dependent activity regulation., 2001, 211(8–9): 458–465.

[20] Theodosiou NA, Xu T. Use of FLP/FRT system to studydevelopment., 1998, 14(4): 355–365.

[21] Nakazawa N, Taniguchi K, Okumura T, Maeda R, Matsuno K. A novel Cre/loxP system for mosaic gene expression in theembryo., 2012, 241(5): 965–974.

[22] Charpentier E, Doudna JA. Biotechnology: rewriting a genome., 2013, 495(7439): 50–51.

[23] Ding D, Chen KY, Chen YD, Li H, Xie KB. Engineering introns to express RNA guides for Cas9- and Cpf1- mediated multiplex genome editing., 2018, 11(4): 542–552.

Conditional editing of thegenome using single transcripts expressing Cas9 and sgRNA

Bingzheng Wang1, Chao Zhang2, Jiali Zhang2, Jin Sun1

The CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR- associated protein 9) system, a highly efficient, simple, and easy genome editing technology, offers significant potential for genetic engineering and has been commonly applied in gene function studies in. However, when using CRISPR/Cas9 system to editgene, Cas9 and sgRNA expression elements exist in differentindividuals, and Cas9 and sgRNA must be integrated into an individual through a complex genetic hybridization process, which has a long and complex operation cycle In this study, on the basis of the CRISPR/Cas9 system, we introduced the tRNA-sgRNA system and triplex elements, used triplex elements to link Cas9 and tRNA-sgRNA genes, stabilized the end of Cas9 mRNA after single transcript cutting, and made the expression of both Cas9 protein and sgRNA with a single transcript a reality. And as we obtained the corresponding phenotypic progeny in one hybridization, genetic manipulation was simplified. We found that conditional knockout of thegene in theeye and thegene in the adult wing disc resulted in corresponding phenotypes that matched expectations using our new conditional gene editing system. So the significant advances in this new conditional gene editing system over the existing CRISPR/Cas9 system are that it is more efficient, extendable, and easy to use.

CRISPR/Cas9; tRNA-sgRNA; triplex elements; conditional gene editing;

2023-04-15;

2023-06-09 ;

2023-07-03

国家自然科学基金项目(编号：31801079)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31801079)]

王秉政，在读硕士研究生，专业方向：果蝇干细胞发育。E-mail: 370756420@qq.com

孙锦，博士，副教授，研究方向：果蝇干细胞发育。E-mail: sunjin@sdfmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-099

(责任编委: 阎言)