伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病的发病机制及治疗研究进展

张翌，吴志英

综 述

伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病的发病机制及治疗研究进展

张翌，吴志英

浙江大学医学院附属第二医院神经内科，医学遗传科/罕见病诊治中心，杭州 310009

伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(cerebral autosomal-dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL)是成人最常见的遗传性脑小血管病。自CADASIL的致病基因被鉴定以来，大量CADASIL病例被报道，但迄今仍缺乏有效的治疗药物。本文针对CADASIL的疾病模型和致病机制、对症药物治疗及潜在治疗方案研究进展进行综述，以期为后续CADASIL发病机制和治疗研究提供参考。

伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病；发病机制；治疗进展

伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(cerebral autosomal dominant arterio­pathy with subcortical infarcts and leukoencephalo­pathy，CADASIL)是成人最常见的遗传性脑小血管病。目前CADASIL流行病学资料仍不完善，既往研究结果显示其发病率至少为2/100,000～ 5/100,000[1]，男女发病无差异。患者多在30～60岁发病，典型症状包括先兆性偏头痛、短暂性脑缺血或缺血性卒中反复发作、认知障碍及精神行为异常等[2]。其临床表型在不同人种中存在异质性，中国CADASIL患者通常在40岁后发病[3]，偏头痛较为少见，而缺血性卒中发生率较高[4]。CADASIL患者可见典型的颅内慢性小动脉病变，例如弥漫性脱髓鞘和腔隙性梗死；镜下可见小穿支动脉和软脑膜动脉病变，表现为动脉壁增厚所致的管腔狭窄和血管平滑肌的形态学变化等[2]。1993年，CADASIL致病基因被定位于人类19号染色体[5]。1996年，Joutel等[6]确认为CADASIL的致病基因，成为诊断CADASIL的金标准。目前已有超过400种基因突变在不同种族人群中被报道[3,4,7～9]。这些突变导致Notch3蛋白发生错误折叠，使细胞外结构域在脑血管的平滑肌细胞和周细胞(统称为壁细胞)上发生聚集，部分Notch3的配体以及细胞外基质蛋白也会聚集在这些沉积物中，称之为嗜锇颗粒物质(granular osmiophilic material，GOM)，这是CADASIL最重要的病理特征[10,11]。但迄今为止，仍未找到针对CADASIL病因或发病机制进行干预的疾病修饰治疗(disease modification therapy，DMT)药物或方法。近年来，有关CADASIL的发病机制和治疗研究取得了较大进展。为此，本文针对CADASIL的疾病模型和致病机制、对症药物治疗及潜在治疗方案研究进展进行综述。

1 CADASIL的发病机制和疾病模型

1.1 NOTCH3基因结构和生物学功能

基因由33个外显子组成，编码一个由2321个氨基酸组成的单次跨膜受体。该受体包含一个胞外结构域、3个Notch/Lin12重复、一个跨膜结构域以及一个胞内结构域。胞外结构域由基因的2～24号外显子编码，包含34个上皮生长因子样重复序列(epidermal growth factor-like repeats，EGFR)。每个EGFR含有6个半胱氨酸残基，形成3对二硫键以稳定该受体的结构。目前报道的绝大多数CADASIL患者的致病变异位于34个EGFR序列上，且涉及半胱氨酸个数的改变，使单个EGFR内的半胱氨酸残基个数由偶数变为奇数，即由正常的6个变为7个或5个，导致Notch3结构发生改变[2]。胞内结构域包含7个锚蛋白重复序列。

Notch3蛋白主要在血管平滑肌细胞和周细胞上表达，由内质网合成后，转运到高尔基体进行糖基化修饰并进行S1剪切，最终定位于细胞膜表面。与其他NOTCH家族成员类似，Notch3在NOTCH信号通路中发挥作用。如图1所示，与配体Jagged或Delta结合后，Notch3将发生S2和S3剪切，其胞内结构域被切割并进入细胞核中，与CSL(core binding factor 1/suppresor of hairless/longevity assurance gene 1)和MAM(mastermind)共同形成转录激活因子复合物，促进下游靶基因的转录，并参与调控血管平滑肌细胞的成熟和分化[12]。

1.2 发病机制

目前CADASIL的发病机制仍未明晰，利用动物模型进行的研究结果提示，突变导致其编码蛋白Notch3的异常是CADASIL发病的主要原因，主要表现为Notch3蛋白的聚集和NOTCH信号通路的异常，并且对血管平滑肌及血管神经单元的结构和功能产生了影响。

1.2.1 Notch3蛋白聚集

发生在Notch3 EGFR区域内半胱氨酸突变可使二硫键产生错配，导致Notch3蛋白发生错误折叠，其胞外结构域在脑血管的平滑肌细胞和周细胞内发生聚集，形成GOM颗粒，可在电镜下被观察到。部分细胞外基质蛋白与Notch3共同定位于GOM颗粒中，包括组织金属蛋白酶抑制因子-3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3，TIMP-3)、玻连蛋白、内皮抑素等[13]。突变的Notch3在细胞中的清除时间延长，这可能与突变导致的血管平滑肌细胞自噬体和溶酶体融合缺陷有关，Notch3不能被正常清除从而发生聚集与沉积。随着病程发展，这些聚集物的毒性会进一步增强，进一步导致内质网应激和细胞凋亡[14]。

尽管目前已知Notch3突变蛋白聚集物形成GOM颗粒与CADASIL发病密切相关，但聚集物中的蛋白是如何相互作用并引起细胞毒性的机制仍不清楚。此外，目前也没有直接证据表明GOM颗粒数量与临床表型的严重程度存在关联，对Notch3突变蛋白聚集物仍需进一步研究。

图1 Notch3信号通路

经转录翻译得到的Notch3蛋白进入高尔基体，发生糖基化修饰并被Furin进行S1剪切。成熟的Notch3蛋白接着被转运至细胞膜上，邻近细胞膜上的配体Delta或Jagged能够结合并激活Notch3信号通路。配体与受体的结合使得Notch3上的S2位点暴露出来，解整合素-金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17)随之进行S2剪切，产生的片段继续被γ-分泌酶进行S3剪切，去除跨膜结构域并释放胞内结构域。胞内结构域被转运至细胞核与CSL和MAM共同形成转录激活因子复合物，激活下游靶基因的转录。

1.2.2 NOTCH信号通路异常

利用小鼠模型进行的研究发现，一般的突变并不会影响Notch3蛋白与配体的结合以及S2和S3剪切[15]。但位于Notch3配体结合结构域上的突变如C428S和C455R则会严重影响NOTCH信号通路。例如，在敲除小鼠模型中，表达正常人源Notch3蛋白能够减少血管壁细胞的损失、挽救小鼠的卒中表型，但表达Notch3 C455R蛋白则无法挽救这些表型[16]。这些结果说明突变是否会导致Notch3蛋白与配体的结合出现障碍与突变所在的EGFR区域有关。

最近的研究表明，在CADASIL患者来源的原代或诱导多能干细胞(induce pluripotent stem cells，iPSCs)分化得到的血管平滑肌细胞中，NOTCH通路靶基因上调，提示了NOTCH通路活性的增强[17]。考虑到非配体结合区域的突变并不影响下游通路，对于大多数突变而言，通路活性的上调可能才是CADASIL的发病机制之一。

1.2.3 血管平滑肌离子通道异常

研究发现，TgNotch3R169C转基因小鼠脑实质小动脉平滑肌细胞膜上的钾离子电压门控通道数量(KV)增加了约60%。因此在40 mmHg生理压力下，小鼠血管平滑肌细胞的去极化程度减小，收缩能力即肌源性紧张度(myogenic tone)减弱。而在使用了KV1通道抑制剂4-氨基吡啶(4-aminopyridine)或表皮生长因子受体激动剂肝素结合EGF(heparin binding epidermal growth factor，HB-EGF)后，能够降低KV电流密度，从而在一定程度上恢复血管平滑肌的肌源性自身调节能力(myogenic response)[18]。此外，在TgNotch3R90C和TgNotch3R169C转基因小鼠中，电生理结果显示梗死灶周围扩散性去极化频率增加，扩散性去极化时细胞外钾离子浓度升高[19]，这提示了细胞外钾离子稳态出现异常可能与离子通道也存在一定相关性。

进一步研究认为，KV数量的增加与GOM颗粒的形成相关。由于TIMP3在GOM中的沉积抑制了ADAM17，上调了电压门控钾离子通道的表达量，从而破坏了脑血管反应性(cerebrovascular reactivity)和肌源性紧张度。在过表达人源TIMP3的转基因小鼠模型中，也观察到了类似CADASIL小鼠模型中出现的脑血管流量和肌源性自身调节的变化[20]。以上结果提示在CADASIL中，钾离子通道的异常可能直接影响血管平滑肌的收缩，从而影响了血管的功能。但目前对于钾离子通道及其他离子通道的研究尚缺乏，仍需未来进一步探索。

1.2.4 血管平滑肌细胞骨架和增殖能力改变

血管平滑肌的细胞骨架结构能够协调血管的收缩和舒张，异常的细胞骨架可能与CADASIL患者血管反应性下降有关。在患者来源的iPSC分化得到的血管平滑肌细胞中，观察到了细胞骨架的异常，表现为平行微丝聚集增多、不规则分布[17,21]。小鼠模型提示NOTCH信号通路的上调进一步导致RhoA/Rho激酶通路蛋白活性升高，考虑到该蛋白在调控细胞骨架中发挥的作用，这可能是CADASIL血管平滑肌细胞细胞骨架异常的原因之一[22]。

目前对于CADASIL患者血管平滑肌的增殖能力改变仍无定论。2018年有研究发现，来自CADASIL患者脐带、胎盘和大脑血管系统的血管平滑肌细胞增殖率低于对照组，患者细胞中转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)表达的增加与血管平滑肌细胞增殖率的下降有关，添加TGF-β中和抗体后，血管平滑肌细胞增殖率显著上升[23]。但后续研究结果显示，患者来源的血管平滑肌细胞和iPSC分化得到的血管平滑肌细胞的细胞增殖能力均增强[17,22]，因此需后续研究来获得确切的结论。

1.2.5 血管神经单元结构和功能障碍

基因突变影响了周细胞、血管内皮细胞、星形胶质细胞等血管神经单元(neurovascular unit，NVU)的正常结构和功能。Notch3突变体对周细胞产生的影响与血管平滑肌细胞类似。随着TgNotch3R169C转基因小鼠年龄增长，其周细胞表面逐渐出现Notch3聚集，最终导致周细胞数量显著减少，对毛细血管的覆盖率降低[24]。

在患者来源iPSC分化得到的血管内皮细胞中并未观察到CADASIL疾病相关表型[17]，但将患者来源的原代血管平滑肌细胞与血管内皮细胞系共培养时，内皮细胞的增殖能力下降，这可能与TGF-β表达量上升有关[23]。有研究发现，内皮细胞的细胞膜离子通道失活也与CADASIL发病相关。毛细血管内皮细胞膜上的内向整流钾通道Kir2.1能够感知神经元活动并且传播电信号，使得上游小动脉扩张并向活跃脑区供血，称为功能性充血。而在TgNotch3R169C转基因小鼠中，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2)的减少导致Kir2.1通道活性降低，进而使得小鼠脑部功能性充血受阻，而全身注射可溶性PIP2则能够迅速恢复小鼠的功能性充血[25]。在该小鼠模型中，还观察到了内皮细胞黏连蛋白表达减少、血浆蛋白渗漏等改变[24]。

对CADASIL患者脑组织切片的免疫组化和免疫荧光结果显示，正常星形胶质细胞数量减少，胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)阳性的星形胶质细胞数量增加，且这些星形胶质细胞出现了细胞质肿胀和空泡化、远端突起的解体和近端突起的碎裂等病理特征，一些自噬标记物如微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein1 light chain 3，MAP1LC3)和p62也定位于这些星形胶质细胞中，提示其正在经历自噬性死亡过程[26]。在TgNotch3R169C转基因小鼠模型中，也观察到了脑微血管星形胶质细胞终足覆盖率降低的现象[24]。

1.3 疾病模型

1.3.1 细胞模型

研究人员最初使用CADASIL患者的原代细胞，例如平滑肌细胞、皮肤成纤维细胞等进行实验。随着iPSC技术的进展，研究人员已成功将CADASIL患者来源的外周血单核细胞或皮肤成纤维细胞诱导形成iPSC，并进一步分化形成血管平滑肌细胞。例如，来源于携带R1076C突变患者的皮肤成纤维细胞分化得到的血管平滑肌细胞，产生了结构和功能异常，包括细胞增殖增加、平行微丝聚集成束。此外，该细胞模型还出现了NOTCH信号通路的上调和NF-κB信号通路的激活，提示炎症反应在CADASIL发病中具有一定作用[17]。另一项研究在R153C和C224T突变的iPSC及分化得到的壁细胞中，发现血小板衍生生长因子受体β (platelet-derived growth factor receptor β，PDGFRβ)表达和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)分泌减少，这可能与毛细血管结构稳定性受损有关[27]。此后的研究在携带C106R、R141C、R182C突变患者来源的血管平滑肌细胞和周细胞中观察到了Notch3胞外结构域的聚集和细胞骨架的异常，但周细胞的标志物PDGFRβ的表达水平高于对照组，不同于之前的结果，这可能与采用不同的细胞分化方案有关。此外，还观察到细胞的迁移速度明显增加，但细胞的增殖率在不同样本间存在较大差异[21]。现有的研究结果表明细胞模型能够为研究CADASIL的发病机制提供一些有益的帮助，但由于体外模型的不稳定性，仍需要借助体内模型来得到最终的结论。

1.3.2 动物模型

近年来，为了阐明CADASIL致病机制并探讨治疗方案，研究人员建立了斑马鱼()、小鼠()等动物模型(表1)。携带突变的斑马鱼转基因模型出现动脉壁的损伤和Notch3下游基因表达的改变，这对于研究Notch3在血管发育中的作用有一定价值，但该模型并不能完全模拟CADASIL的表型，因此还需要其他模型的支持[28]。目前应用最广的是TgNotch3R90C和TgNotch3R169C转基因小鼠模型，这两种突变均为CADASIL患者的高频突变，分别位于基因的3号和4号外显子上[3]。

TgNotch3R90C转基因小鼠是通过显微注射线性化的cDNA片段构建的，cDNA片段由平滑肌特异性启动子SM22α和人源R90C cDNA组成，因此可在血管平滑肌细胞中特异性表达突变的Notch3蛋白。该小鼠产生了血管平滑肌的退化，包括细胞骨架的改变、细胞外基质锚定异常等表型，且这些变化在胞外结构域沉积形成GOM颗粒之前即已发生[31]。血管平滑肌细胞的退化导致小鼠出现了脑血管反应性损伤、线粒体损伤、自噬减弱等表型[37]。但是Notch3 R90C的蛋白活性没有明显变化，突变的受体仍然能够与配体结合并启动下游信号通路[32]。这提示CADASIL的发病机制可能并不涉及信号通路的破坏，而是与突变蛋白的功能获得(gain of function)相关。

表1 CADASIL动物模型

TgNotch3R169C转基因小鼠同样通过显微注射构建，cDNA片段来源于从文库中筛选得到的包含大鼠基因的克隆，通过PCR引入R169C点突变，再将其酶切为线性化片段，用于显微注射。与TgNotch3R90C转基因小鼠一样，在TgNotch3R169C转基因小鼠的血管平滑肌细胞中也观察到了Notch3胞外结构域的聚集体及形成的GOM颗粒，且更早出现。此外，还观察到小鼠脑部的白质损伤，在损伤区域和非损伤区域均出现了低灌注现象，这提示低灌注可能参与白质损伤的过程[33]。因此，该模型已被广泛用于研究CADASIL机制和治疗。利用该模型，研究者已证实内质网应激和RhoA/Rho激酶在CADASIL发病中的重要作用，通过抑制内质网应激的药物能够挽救血管功能障碍[22]。由于该小鼠尚未出现脑梗死等表型，该模型可用来模拟CADASIL患者早期阶段的表现。

除了以上两种常用的小鼠模型，研究者还建立了其他CADASIL小鼠模型。例如，TgNotch3C428S和TgNotch3C455R转基因小鼠所带的突变位于Notch3的配体结合结构域，直接影响了蛋白正常的信号转导，这两种小鼠均出现了Notch3胞外结构域的聚集和血管平滑肌的退化[35,36]；TgNotch3R182C和TgNotch3R1031C转基因小鼠亦表现出CADASIL的典型病理特征，包括Notch3胞外结构域的聚集体和GOM颗粒形成，除此之外，在TgNotch3R1031C转基因小鼠中还观察了到簇集素(clusterin)和内皮抑素的聚集[34,36]。敲除小鼠尽管无明显CADASIL表型，亦未观察到血管中GOM颗粒的形成，但的敲除会影响血管的分化，包括血管平滑肌细胞的减少、血脑屏障渗漏、脑血管反应性和肌源性紧张度的改变等，增加了小鼠发生缺血性卒中的风险，这也为Notch3在脑血管成熟和稳态中起重要作用提供了实验依据[29,30]。

2 CADASIL的药物治疗

目前仍缺乏对CADASIL的特效治疗药物，其治疗以对症治疗为主，同时辅以必要的预防措施[38]。

缺血性卒中的治疗可依据常规的治疗方案进行。抗血小板药物可以用于反复发生卒中的患者，但当患者脑部已有大量微出血时，应慎重选择抗血小板药物或抗凝药物以免加重脑出血现象。盐酸洛美嗪是治疗偏头痛的药物，但2020年的一项研究结果提示该药还能有效预防继发性卒中[39]。除此之外，静脉注射组织型纤溶酶原激活剂(intravenous tissue plasminogen activator，IV tPA)也被尝试用于治疗CADASIL患者急性卒中发作，但因有证据表明该药增加了CADASIL患者脑出血的风险，其安全性仍存在争议[40]。

CADASIL患者偏头痛的治疗与一般偏头痛一致，乙酰唑胺对偏头痛有一定疗效，但应尽量避免使用曲普坦类和麦角类血管收缩性药物。

常规治疗认知损伤的药物目前也被用于治疗CADASIL患者的认知障碍，但研究表明多奈哌齐对CADASIL患者的血管性痴呆量表评分无明显改善，仅对一些认知执行次要指标有一定效果[41]。

大多数用于非心源性栓塞的预防措施都可以用于CADASIL患者，控制高血压等脑血管病的危险因素可减缓疾病进展。

3 潜在治疗方案研究

3.1 生长因子疗法

干细胞因子(stem cell factor，SCF)和粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是血细胞生成、骨髓干细胞存活及动员所必需的造血生长因子。为探究SCF和G-CSF是否对CADASIL小鼠具有神经保护和修复作用，研究者对TgNotch3R90C转基因小鼠反复皮下注射SCF和G-CSF，免疫荧光结果显示小鼠小动脉血管平滑肌的退化减轻，细胞凋亡减少，内皮细胞损失被抑制，脑血管密度增加，水迷宫实验显示小鼠认知功能明显改善。在体外模型中，SCF联合G-CSF能够通过抑制AKT信号通路和Caspase-3活性来减少血管平滑肌细胞凋亡[42]。之后，该研究小组通过骨髓移植示踪骨髓源性细胞和共聚焦成像的方法，观察到TgNotch3R90C转基因小鼠的脑小血管和毛细血管中血栓形成，血栓内部及周围可见变性血管内皮细胞，在血栓形成区域及邻近区域可见IgG外渗，而SCF联合G-CSF干预能够显著减少毛细血管血栓形成和IgG外渗。进一步给9月龄和10月龄小鼠皮下注射SCF和G-CSF，发现血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)水平显著上调，促进了神经元结构再生，脑血管单元得到恢复。而使用VEGF-A的血管生成抑制剂阿瓦斯汀(avastin)预处理小鼠后，则完全阻碍了SCF联合G-CSF发挥作用[43]。该研究围绕SCF和G-CSF的作用效果和治疗机制展开，为CADASIL的生长因子疗法提供了新视角(图2A)。

3.2 免疫疗法

2017年，Machuca-Parra等[16]在敲除小鼠中观察到血管壁细胞的损失。利用Cre-LoxP系统，他们在KO小鼠中实现了条件性表达野生型(wild type，WT)或C455R突变的人源基因，C455R突变位于Notch3配体结构域，严重破坏了Notch3信号通路。他们发现，WT基因能够减少壁细胞的损失和血管渗漏，但C455R突变的基因不能挽救以上表型，这提示NOTCH3信号通路对于血管壁细胞的覆盖率起到重要作用。之前的研究表明，Notch3的激动剂A13抗体能够使Notch3的负调控区域(包含Notch/Lin12重复)变得不稳定，从而激活Notch3。因此，他们利用TgNotch3C455R小鼠模型进一步研究发现，使用A13能够激活Notch3 C455R突变受体并启动下游信号通路，使得小鼠血管壁细胞损失减少[16]。该研究表明Notch3激动剂抗体A13对携带配体结构域突变的CADASIL患者具有潜在的治疗作用(图2B)。

2018年，Ghezali等[44]利用TgNotch3R169C转基因小鼠探索5E1单克隆抗体的治疗潜力，他们发现5E1能够与该小鼠脑动脉和毛细血管中沉积的Notch3蛋白胞外结构域结合。但长期注射5E1抗体后，Notch3和GOM颗粒并没有显著减少，亦未阻止脑白质的进一步损害。5E1抗体无法清除GOM沉颗粒可能与小鼠小胶质细胞功能丧失有关。尽管如此，此治疗方案改善了脑血流对血管扩张剂的反应性，并使动脉肌源性紧张度正常化，从而发挥保护脑血管的功能(图2B)。

2022年，Oliveira等[45]对TgN3R182C150转基因小鼠进行了主动免疫治疗，自小鼠3月龄起，每2周向小鼠注射WT EGFR1～5和R133C EGFR1～5混合物，至7月龄止。结果显示，实验组小鼠大脑毛细血管的Notch3沉积明显减少约38%～48%，小胶质细胞激活增加，血清中Notch3胞外结构域水平下降。此外，主动免疫疗法未影响小鼠体重、行为、血管平滑肌细胞的数量和完整性、神经元存活率。该研究首次在小鼠模型中成功减少了Notch3的聚集，为后续的临床应用提供了支撑(图2B)。

近年来，人们利用CADASIL疾病小鼠模型检验了多种免疫疗法的效果，这些疗法旨在清除Notch3蛋白沉积或激活Notch3信号通路，部分减轻了疾病小鼠模型的症状，显示了免疫疗法的治疗潜力。对于被动疗法，研究者未来还需将抗体跨越血脑屏障的能力纳入考虑；对于主动疗法，应继续探索其安全性以及在老年小鼠中的长期疗效。因此，CADASIL的免疫疗法仍有待进一步完善。

3.3 基因疗法

由于Notch3毒性聚集体的产生来源于单个EGFR中半胱氨酸数量的改变，有研究者提出如下假说：去除含有突变的EGFR可以减轻Notch3的聚集。为了验证这个假说，Rutten等[46]将反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)外显子跳跃技术应用于CADASIL的治疗研究。ASO是一类设计合成的小RNA或DNA，能够与特定的mRNA前体配对，以调控mRNA前体的剪切或翻译。ASO技术在多种遗传病的临床试验中都表现出良好的效果，例如杜氏肌营养不良和脊髓性肌萎缩等。在调控剪切时，ASO与靶向的外显子特异性结合，使得该外显子无法与剪切原件正确结合，与两端的内含子一起被切除，最终无法进入成熟的mRNA中。

Rutten等[46]的研究基于以下假设：由于Notch3含有34个EGFR，外显子跳跃导致1个或2个EGFR的缺失并不影响Notch3细胞外结构域的功能。因此，根据以下原则以及软件预测结果，他们发现2～24号外显子中有18个外显子可以被跳跃：(1)外显子跳跃后编码区不发生移码；(2)外显子跳跃后形成新的EGFR符合保守序列特征(含有6个半胱氨酸残基且空间位置正确)。研究人员选择了高加索人群的外显子(第2～6号外显子)突变热点进行实验，他们首先构建了模拟外显子跳跃的cDNA，通过在HEK293T细胞和患者来源的成纤维细胞中进行了蛋白表达量、细胞定位、配体结合等功能实验验证，确认了经外显子跳跃后的受体能够正确表达定位并正常发挥其在Notch3信号通路中的功能。接着，他们在患者来源的成纤维细胞和血管平滑肌细胞中转染了单条或多条ASO，经RT-PCR和qPCR验证，含有突变的外显子被成功跳跃且没有影响Notch3下游蛋白的表达。该研究为CADASIL的治疗提供了新思路(图2C)。

图2 CADASIL潜在治疗方案

A：生长因子疗法；B：免疫疗法；C：基因疗法。

2020年，该研究小组又报道了1例自然发生的9号外显子跳跃病例[47]。该患者携带c.1492G>T (p.Gly498Cys)杂合突变，提取患者成纤维细胞mRNA逆转录后进行Sanger测序，发现含有突变的等位基因的转录本大多缺失了9号外显子。该患者临床症状相比于其他CADASIL患者轻，皮肤活检的电镜结果显示，其血管壁附近的Notch3聚集体也较少。这项研究为CADASIL外显子跳跃疗法的有效性第一次提供了患者体内证据。接着，他们在平滑肌细胞和NIH 3T3细胞系中转染了9号外显子缺失的cDNA，发现其编码的蛋白能够正确于定位于细胞表面，但由于9号外显子编码的部分EGFR 11参与Notch3配体结合结构域(EGFR 10和11)的组成，9号外显子缺失的Notch3蛋白信号转导功能减弱。最后，他们在患者来源的血管平滑肌细胞中转染了靶向9号外显子的ASO，并成功实现了9号外显子的跳跃。虽然这些工作仅在细胞水平上进行，但仍为CADASIL的基因疗法提供了新视角。随着基因编辑治疗的发展[48]，利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术校正突变来治疗CADASIL也是未来的发展方向之一。

4 结语与展望

自CADASIL的致病基因被鉴定以来，大量CADASIL病例被报道，对于该疾病的机制研究也不断深入。现有机制研究结果表明，Notch3突变蛋白能够聚集于血管壁细胞表面，并和细胞外基质蛋白形成GOM，通过影响血管平滑肌信号通路、细胞骨架、膜离子通道及其他血管神经单元结构，损伤脑小血管的结构和功能。

目前临床上用于CADASIL患者的药物均为对症治疗药物，主要用于缓解偏头痛、治疗脑卒中、减轻认知功能损伤等。此外，通过控制血压、戒烟等方式可以在一定程度上起到预防作用，但迄今仍缺乏有效治疗CADASIL的药物。

基于CADASIL机制研究的进展，近些年来对于CADASIL的生长因子疗法、免疫疗法和基因疗法的研究逐渐深入。生长因子疗法通过联合补充SCF和G-CSF，改善了血管平滑肌及其他血管神经单元的功能。免疫疗法使用靶向Notch3蛋白不同结构域的抗体，介导Notch3突变蛋白的清除或激活NOTCH信号通路，以改善脑血管反应性。基因疗法通过ASO介导外显子跳跃，以获得不含突变且能正常发挥功能的Notch3蛋白。不少研究具有重要的临床应用价值。

未来，仍需继续深入研究CADASIL的发病机制，包括Notch3蛋白沉积的原因、血管平滑肌细胞结构和功能异常的机制等。同时进一步探索CADASIL的治疗方案，例如，可探索不同生长因子组合疗法以更好地改善血管神经单元功能，也可生产靶向Notch3不同结构域的抗体以提高Notch3突变体的清除率。此外，CADASIL作为一种单基因遗传病，基因治疗的研究前景也十分广阔，例如，可设计靶向突变mRNA的ASO，诱导此mRNA的降解，减少突变蛋白的生成，也可使用CRISPR-Cas9系统直接修正致病突变。

总之，应继续推进CADASIL发病机制研究，完善目前已有的潜在治疗方案，促进CADASIL特异性治疗方案的研发，为患者提供更多有效的治疗选择。

[1] Rutten JW, Dauwerse HG, Gravesteijn G, van Belzen MJ, van der Grond J, Polke JM, Bernal-Quiros M, Lesnik Oberstein SAJ. Archetypal NOTCH3 mutations frequent in public exome: implications for CADASIL., 2016, 3(11): 844–853.

[2] Chabriat H, Joutel A, Dichgans M, Tournier-Lasserve E, Bousser MG. Cadasil., 2009, 8(7): 643– 653.

[3] Chen S, Ni W, Yin XZ, Liu HQ, Lu C, Zheng QJ, Zhao GX, Xu YF, Wu L, Zhang L, Wang N, Li HF, Wu ZY. Clinical features and mutation spectrum in Chinese patients with CADASIL: a multicenter retrospective study., 2017, 23(9): 707–716.

[4] Ni W, Zhang Y, Zhang L, Xie JJ, Li HF, Wu ZY. Genetic spectrum of NOTCH3 and clinical phenotype of CADASIL patients in different populations., 2022, 28(11): 1779–1789.

[5] Tournier-Lasserve E, Joutel A, Melki J, Weissenbach J, Lathrop GM, Chabriat H, Mas JL, Cabanis EA, Baud­rimont M, Maciazek J. Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoence­pha­lopathy maps to chromosome 19q12., 1993, 3(3): 256–259.

[6] Joutel A, Corpechot C, Ducros A, Vahedi K, Chabriat H, Mouton P, Alamowitch S, Domenga V, Cécillion M, Marechal E, Maciazek J, Vayssiere C, Cruaud C, Cabanis EA, Ruchoux MM, Weissenbach J, Bach JF, Bousser MG, Tournier-Lasserve E. Notch3 mutations in CADASIL, a hereditary adult-onset condition causing stroke and dementia., 1996, 383(6602): 707–710.

[7] Stenson PD, Ball EV, Mort M, Phillips AD, Shiel JA, Thomas NST, Abeysinghe S, Krawczak M, Cooper DN. Human gene mutation database (HGMD): 2003 update., 2003, 21(6): 577–581.

[8] Bianchi S, Zicari E, Carluccio A, Di Donato I, Pescini F, Nannucci S, Valenti R, Ragno M, Inzitari D, Pantoni L, Federico A, Dotti MT. CADASIL in central Italy: a retrospective clinical and genetic study in 229 patients., 2015, 262(1): 134–141.

[9] Joutel A, Vahedi K, Corpechot C, Troesch A, Chabriat H, Vayssiere C, Cruaud C, Maciazek J, Weissenbach J, Bousser MG, Bach JF, Tournier-Lasserve E. Strong clustering and stereotyped nature of Notch3 mutations in CADASIL patients., 1997, 350(9090): 1511– 1515.

[10] Joutel A, Andreux F, Gaulis S, Domenga V, Cecillon M, Battail N, Piga N, Chapon F, Godfrain C, Tournier- Lasserve E. The ectodomain of the Notch3 receptor accumulates within the cerebrovasculature of CADASIL patients., 2000, 105(5): 597–605.

[11] Joutel A, Favrole P, Labauge P, Chabriat H, Lescoat C, Andreux F, Domenga V, Cécillon M, Vahedi K, Ducros A, Cave-Riant F, Bousser MG, Tournier-Lasserve E. Skin biopsy immunostaining with a Notch3 monoclonal anti­body for CADASIL diagnosis., 2001, 358(9298): 2049–2051.

[12] Schweisguth F. Regulation of notch signaling activity., 2004, 14(3): 129–138.

[13] Monet-Leprêtre M, Haddad I, Baron-Menguy C, Fouillot- Panchal M, Riani M, Domenga-Denier V, Dussaule C, Cognat E, Vinh J, Joutel A. Abnormal recruitment of extracellular matrix proteins by excess Notch3 ECD: a new pathomechanism in CADASIL., 2013, 136(Pt 6): 1830–1845.

[14] Schoemaker D, Arboleda-Velasquez JF. Notch3 signaling and aggregation as targets for the treatment of CADASIL and other NOTCH3-associated small-vessel diseases., 2021, 191(11): 1856–1870.

[15] Cognat E, Baron-Menguy C, Domenga-Denier V, Cleo­phax S, Fouillade C, Monet-Leprêtre M, Dewerchin M, Joutel A. Archetypal Arg169Cys mutation in NOTCH3 does not drive the pathogenesis in cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leucoencephalopathy via a loss-of-function mechanism., 2014, 45(3): 842–849.

[16] Machuca-Parra AI, Bigger-Allen AA, Sanchez AV, Boutabla A, Cardona-Vélez J, Amarnani D, Saint-Geniez M, Siebel CW, Kim LA, D'Amore PA, Arboleda-Velasquez JF. Therapeutic antibody targeting of Notch3 signaling prevents mural cell loss in CADASIL., 2017, 214(8): 2271–2282.

[17] Ling C, Liu ZP, Song MS, Zhang WQ, Wang S, Liu XQ, Ma S, Sun SH, Fu LN, Chu Q, Belmonte JCI, Wang ZX, Qu J, Yuan Y, Liu GH. Modeling CADASIL vascular pathologies with patient-derived induced pluripotent stem cells., 2019, 10(4): 249–271.

[18] Dabertrand F, Krøigaard C, Bonev AD, Cognat E, Dalsgaard T, Domenga-Denier V, Hill-Eubanks DC, Bray­den JE, Joutel A, Nelson MT. Potassium channelopathy- like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfun­ction in a genetic model of small vessel disease., 2015, 112(7): E796–E805.

[19] Oka F, Lee JH, Yuzawa I, Li M, von Bornstaedt D, Eikermann-Haerter K, Qin T, Chung DY, Sadeghian H, Seidel JL, Imai T, Vuralli D, Platt RM, Nelson MT, Joutel A, Sakadzic S, Ayata C. CADASIL mutations sensitize the brain to ischemia via spreading depolarizations and abnormal extracellular potassium homeostasis., 2022, 132(8): e149759.

[20] Capone C, Dabertrand F, Baron-Menguy C, Chalaris A, Ghezali L, Domenga-Denier V, Schmidt S, Huneau C, Rose-John S, Nelson MT, Joutel A. Mechanistic insights into a TIMP3-sensitive pathway constitutively engaged in the regulation of cerebral hemodynamics., 2016, 5: e17536.

[21] Yamamoto Y, Kojima K, Taura D, Sone M, Washida K, Egawa N, Kondo T, Minakawa EN, Tsukita K, Enami T, Tomimoto H, Mizuno T, Kalaria RN, Inagaki N, Takahashi R, Harada-Shiba M, Ihara M, Inoue H. Human iPS cell-derived mural cells as anmodel of hereditary cerebral small vessel disease., 2020, 13(1): 38.

[22] Neves KB, Harvey AP, Moreton F, Montezano AC, Rios FJ, Alves-Lopes R, Nguyen Dinh Cat A, Rocchicciolli P, Delles C, Joutel A, Muir K, Touyz RM. ER stress and Rho kinase activation underlie the vasculopathy of CADASIL., 2019, 4(23): e131344.

[23] Panahi M, Yousefi Mesri N, Samuelsson EB, Coupland KG, Forsell C, Graff C, Tikka S, Winblad B, Viitanen M, Karlström H, Sundström E, Behbahani H. Differences in proliferation rate between CADASIL and control vascular smooth muscle cells are related to increased TGFbeta expression., 2018, 22(6): 3016–3024.

[24] Ghosh M, Balbi M, Hellal F, Dichgans M, Lindauer U, Plesnila N. Pericytes are involved in the pathogenesis of cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy., 2015, 78(6): 887–900.

[25] Dabertrand F, Harraz OF, Koide M, Longden TA, Rosehart AC, Hill-Eubanks DC, Joutel A, Nelson MT. PIP(2) corrects cerebral blood flow deficits in small vessel disease by rescuing capillary Kir2.1 activity., 2021, 118(17): e2025998118.

[26] Hase Y, Chen AQ, Bates LL, Craggs LJL, Yamamoto Y, Gemmell E, Oakley AE, Korolchuk VI, Kalaria RN. Severe white matter astrocytopathy in CADASIL., 2018, 28(6): 832–843.

[27] Kelleher J, Dickinson A, Cain S, Hu YH, Bates N, Harvey A, Ren JZ, Zhang WJ, Moreton FC, Muir KW, Ward C, Touyz RM, Sharma P, Xu QB, Kimber SJ, Wang T. Patient-specific iPSC model of a genetic vascular dementia syndrome reveals failure of mural cells to stabilize capillary structures., 2019, 13(5): 817–831.

[28] Zaucker A, Mercurio S, Sternheim N, Talbot WS, Marlow FL. Notch3 is essential for oligodendrocyte development and vascular integrity in zebrafish., 2013, 6(5): 1246–1259.

[29] Arboleda-Velasquez JF, Zhou ZP, Shin HK, Louvi A, Kim HH, Savitz SI, Liao JK, Salomone S, Ayata C, Moskowitz MA, Artavanis-Tsakonas S. Linking Notch signaling to ischemic stroke., 2008, 105(12): 4856–4861.

[30] Domenga V, Fardoux P, Lacombe P, Monet M, Maciazek J, Krebs LT, Klonjkowski B, Berrou E, Mericskay M, Li Z, Tournier-Lasserve E, Gridley T, Joutel A. Notch3 is required for arterial identity and maturation of vascular smooth muscle cells., 2004, 18(22): 2730– 2735.

[31] Ruchoux MM, Domenga V, Brulin P, Maciazek J, Limol S, Tournier-Lasserve E, Joutel A. Transgenic mice expressing mutant Notch3 develop vascular alterations characteristic of cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcor­tical infarcts and leukoencephalopathy., 2003, 162(1): 329–342.

[32] Monet M, Domenga V, Lemaire B, Souilhol C, Langa F, Babinet C, Gridley T, Tournier-Lasserve E, Cohen- Tannoudji M, Joutel A. The archetypal R90C CADASIL- NOTCH3 mutation retains NOTCH3 function in vivo., 2007, 16(8): 982–992.

[33] Joutel A, Monet-Leprêtre M, Gosele C, Baron-Menguy C, Hammes A, Schmidt S, Lemaire-Carrette B, Domenga V, Schedl A, Lacombe P, Hubner N. Cerebrovascular dysfunction and microcirculation rarefaction precede white matter lesions in a mouse genetic model of cerebral ischemic small vessel disease., 2010, 120(2): 433–445.

[34] Rutten JW, Klever RR, Hegeman IM, Poole DS, Dauwerse HG, Broos LAM, Breukel C, Aartsma-Rus AM, Verbeek JS, van der Weerd L, van Duinen SG, van den Maag­denberg AMJM, Lesnik Oberstein SAJ. The NOTCH3 score: a pre-clinical CADASIL biomarker in a novel human genomic NOTCH3 transgenic mouse model with early progressive vascular NOTCH3 accumulation., 2015, 3: 89.

[35] Monet-Leprêtre M, Bardot B, Lemaire B, Domenga V, Godin O, Dichgans M, Tournier-Lasserve E, Cohen- Tannoudji M, Chabriat H, Joutel A. Distinct phenotypic and functional features of CADASIL mutations in the Notch3 ligand binding domain., 2009, 132(Pt 6): 1601–1612.

[36] Arboleda-Velasquez JF, Manent J, Lee JH, Tikka S, Ospina C, Vanderburg CR, Frosch MP, Rodriguez-Falcon M, Villen J, Gygi S, Lopera F, Kalimo H, Moskowitz MA, Ayata C, Louvi A, Artavanis-Tsakonas S. Hypomorphic Notch 3 alleles link Notch signaling to ischemic cerebral small-vessel disease., 2011, 108(21): E128–E135.

[37] Gu X, Liu XY, Fagan A, Gonzalez-Toledo ME, Zhao LR. Ultrastructural changes in cerebral capillary pericytes in aged Notch3 mutant transgenic mice., 2012, 36(1): 48–55.

[38] Chinese Society of Neurology, Chinese Stroke Society. Chinese guideline for diagnosis and treatment of cerebral small vessel disease 2020., 2022, 55(8): 807–818.中华医学会神经病学分会，中华医学会神经病学分会脑血管病学组. 中国脑小血管病诊治指南2020. 中华神经科杂志，2022, 55(8): 807–818.

[39] Watanabe-Hosomi A, Mizuta I, Koizumi T, Yokota I, Mukai M, Hamano A, Kondo M, Fujii A, Matsui M, Matsuo K, Ito K, Teramukai S, Yamada K, Nakagawa M, Mizuno T. Effect of lomerizine hydrochloride on preventing strokes in patients with cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy., 2020, 43(5): 146–150.

[40] Khan MT, Murray A, Smith M. Successful use of intravenous tissue plasminogen activator as treatment for a patient with cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy: a case report and review of literature., 2016, 25(4): e53–e57.

[41] Dichgans M, Markus HS, Salloway S, Verkkoniemi A, Moline M, Wang Q, Posner H, Chabriat HS. Donepezil in patients with subcortical vascular cognitive impairment: a randomised double-blind trial in CADASIL., 2008, 7(4): 310–318.

[42] Liu XY, Gonzalez-Toledo ME, Fagan A, Duan WM, Liu YY, Zhang SY, Li B, Piao CS, Nelson L, Zhao LR. Stem cell factor and granulocyte colony-stimulating factor exhibit therapeutic effects in a mouse model of CADASIL., 2015, 73: 189–203.

[43] Ping SN, Qiu XC, Kyle M, Hughes K, Longo J, Zhao LR. Stem cell factor and granulocyte colony-stimulating factor promote brain repair and improve cognitive function through VEGF-A in a mouse model of CADASIL., 2019, 132: 104561.

[44] Ghezali L, Capone C, Baron-Menguy C, Ratelade J, Christensen S, Østergaard Pedersen L, Domenga-Denier V, Pedersen JT, Joutel A. Notch3(ECD) immunotherapy improves cerebrovascular responses in CADASIL mice., 2018, 84(2): 246–259.

[45] Oliveira DV, Coupland KG, Shao WC, Jin SB, Del Gaudio F, Wang SL, Fox R, Rutten JW, Sandin J, Zetterberg H, Lundkvist J, Lesnik Oberstein SA, Lendahl U, Karlström H. Active immunotherapy reduces NOTCH3 deposition in brain capillaries in a CADASIL mouse model., 2022, 15(2): e16556.

[46] Rutten JW, Dauwerse HG, Peters DJM, Goldfarb A, Venselaar H, Haffner C, van Ommen GJB, Aartsma-Rus AM, Lesnik Oberstein SAJ. Therapeutic NOTCH3 cysteine correction in CADASIL using exon skipping: in vitro proof of concept., 2016, 139(Pt 4): 1123–1135.

[47] Gravesteijn G, Dauwerse JG, Overzier M, Brouwer G, Hegeman I, Mulder AA, Baas F, Kruit MC, Terwindt GM, van Duinen SG, Jost CR, Aartsma-Rus A, Lesnik Oberstein SAJ, Rutten JW. Naturally occurring NOTCH3 exon skipping attenuates NOTCH3 protein aggregation and disease severity in CADASIL patients., 2020, 29(11): 1853–1863.

[48] Liu Y, Zhou XH, Huang SH, Wang XL. Prime editing: a search and replace tool with versatile base changes., 2022, 44(11): 993–1008.刘尧，周先辉，黄舒泓，王小龙. 引导编辑：突破碱基编辑类型的新技术. 遗传，2022, 44(11): 993–1008.

Pathogenesis and therapeutic advances of cerebral autosomal- dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy

Yi Zhang, Zhi-Ying Wu

Cerebral autosomal-dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy (CADASIL) is the most common hereditary cerebral small vessel disease in adults. Many CADASIL cases were reported afterwas identified as the causative gene of CADASIL. However, there is still no specific and effective therapies for CADASIL. In this review, we summarize recent research progress on disease models, symptomatic treatments and potential therapies for CADASIL, thereby providing a reference for follow-up CADASIL treatment research.

CADASIL; pathogenesis; therapeutic advances

2023-02-01;

2023-04-27;

2023-05-09

张翌，在读博士研究生，专业方向：神经遗传病。E-mail: zhangyi_@zju.edu.cn

吴志英，博士，主任医师，研究方向：神经遗传病和变性病。E-mail: zhiyingwu@zju.edu.cn

10.16288/j.yczz.23-023

(责任编委: 夏昆)