一例婴儿神经轴索营养不良的诊疗与基因检测分析

宫为大，陶钢，赵甜甜，杨悦，纪红

遗传资源

一例婴儿神经轴索营养不良的诊疗与基因检测分析

宫为大，陶钢，赵甜甜，杨悦，纪红

安徽省芜湖市第一人民医院康复科，芜湖 241060

婴儿神经轴索营养不良(infantile neuroaxonal dystrophy，INAD)是一种罕见的常染色体隐性遗传神经退行性疾病，主要临床表现为早期肌张力降低，可快速进展为精神运动发育倒退、锥体束征阳性及痉挛型四肢瘫痪。本文报道1例中国INAD患儿，该患儿表现为肌张力降低，运动及语言发育迟缓，康复训练后得到改善。基因检测结果提示该患儿基因发生复合杂合变异，分别来自父亲携带的杂合子变异c.496dupG (p.Glu166fsTer32)及其母亲携带的杂合子变异c.2189T>G (p.Met730Arg)。变异p.Met730Arg尚未被报道，蛋白结构预测该变异蛋白结构稳定性可能发生改变，体外检测结果表明该变异蛋白表达量显著降低。本研究进一步丰富了基因变异谱，有助于提升临床医生对INAD疾病的诊断意识。

婴儿神经轴索营养不良（INAD）；PLA2G6；康复治疗

神经退行性脑铁积累症(neurodegeneration with brain iron accumulation，NBIA)是一种罕见的遗传性神经系统疾病，具有进行性认知和/或运动功能障碍，以及基底节铁沉积增加的临床特征[1]。目前已发现有15个基因缺陷与NBIA发生有关，其中包括编码非Ca2+依赖型磷脂酶活性蛋白VIA-2型(iPLA2β)的基因，该基因变异可导致神经细胞膜磷脂代谢紊乱以及细胞内铁沉积等[1,2]。与基因变异相关的疾病称为磷脂酶A2相关神经退行性病变(PLA2G6- associated neurodegeneration，PLAN)，是一组具有表型异质性的常染色体隐性遗传疾病，包括婴儿神经轴索营养不良(infantile neuroaxonal dystrophy，INAD)、非典型性神经轴索营养不良(atypical neuroaxonal dystrophy，ANAD)及早发性帕金森综合征等[3]。INAD是发病年龄最早且临床表现严重的一种亚型，患儿通常可在6月龄至3岁间发病，并表现为进行性精神运动发育倒退、张力减退、小脑共济失调、痉挛型四肢瘫痪及视力障碍等[3,4]。由于INAD表型缺乏特异性且病例罕见，并易与脑瘫及痉挛性截瘫等疾病混淆，因此临床诊断难度较大。

本文报道1例INAD患儿的诊断与康复治疗过程，基因检测结果提示其基因发生复合杂合变异，并通过蛋白结构预测及体外功能实验分析变异潜在有害性。本研究丰富基因变异谱，并为INAD疾病遗传学研究提供新的临床资料以及提示临床康复训练的重要性。

1 对象与方法

1.1 研究对象及临床资料收集

患者，女，19月龄，汉族，系其母第一胎第一产，该患儿因“发育迟缓”于2022年10月收治本院康复科。收集患者病史，完善体格检查、辅助检查、影像学检查以及基因检测等临床资料。本研究已获得患者家长知情同意，并通过芜湖市第一人民医院医学伦理委员会审查。

1.2 基因检测及变异分析

采集患儿及家属外周血各约3 mL，根据基因DNA提取试剂盒(江苏康为世纪生物科技股份有限公司)说明提取白细胞DNA，通过建立全外显子组文库后上机高通量测序仪NovaSeq6000(美国因美纳公司)进行测序，下机数据经人类基因组GRCh37/hg19版本参考序列比对后进行质控过滤并得到变异谱，变异查看包括dbSNP、ExAC及千人基因组等正常人群分布数据库，并应用在线平台SIFT(http://sift. jcvi.org/)、Polyphen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)和MutationTaster (http://www.mutationtaster.org/)预测变异生物危害性。美国医学遗传学和基因组学(American College of Medical Genetics，ACMG)指南对变异进行致病性评级[5]。变异参考Ensemble数据库设计引物，再应用ABI 3500XL分析仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)进行Sanger验证。

1.3 变异保守性分析

通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)检索PLA2G6蛋白，选择不同物种氨基酸序列后应用Align功能对序列进行比对分析。

1.4 变异型蛋白结构分析

在蛋白质数据库中查询PLA2G6蛋白序列和结构信息(https://www.uniprot.org/)并下载蛋白3D结构文件，所有缺失残基和Loop结构使用modeller10.2软件进行补全，变异型结构使用PyMOL 2.4版本软件在野生型结构基础上进行构建，使用H++服务器(http://newbiophysics.cs.vt.edu/H++/)预测蛋白质子化状态后使用PyMOL 2.4版本软件Align功能进行对比，最后分析变异蛋白结构局部变化。

1.5 变异型蛋白表达体外实验

在含10%胎牛血清的高糖细胞培养基(美国Gibco公司)中培养人293T细胞(上海细胞库)，并在6孔板内培养至细胞密度达70%时使用Lipofec­tamine 3000试剂(货号：#L3000150，美国赛默飞公司)进行质粒转染。使用pECMV-FLAG-N载体，并按照Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase (货号：#P505，中国诺唯赞公司)试剂盒说明进行PLA2G6野生型组(PLA2G6-WT)质粒构建，扩增引物：上游引物5′-GACGACGATAAGACTAAGCTTATGCAG­TTCTTTGGCCGCC-3′；下游引物5′-TGCTGGATA­TCTGCAGAATTCTCAGGGTGAGAGCAGCAGCT­GGA-3′。随后按照Mut Express MultiS Fast Muta­genesis Kit V2(货号：#C215，中国诺唯赞公司)说明构建变异型组(PLA2G6-MUT)，扩增引物：上游引物5′-AAGGAACTGGGCAAGAGGGTG­GTGGACTG­­T­TGCACGG-3′；下游引物5′-CTCTTG­CCCAG­TT­CCTTGGCCCCAAAAACAGT-3′。经测序验证后进行质粒扩增提取。将转染后的PLA2G6-WT及PLA2G6-MUT细胞应用蛋白裂解液(中国碧云天公司)提取蛋白后进行Western blot(WB)实验分析蛋白表达量，结果使用Image J软件分析。抗体信息：一抗鼠抗人FLAG (货号：#8146，美国CST公司)，稀释比例均为1∶1000；二抗Anti-mouse IgG，HRP-linked Antibody (货号：#7076，美国CST公司)，稀释比例为1∶5000。

2 结果与分析

2.1 患者临床表现

该患儿7月龄起出现四肢无力症状，10月龄仍不能独坐，在19月龄时因“独立行走不稳伴语言发育迟缓”就诊。入院体格检查：神志清、反应一般、易哭闹、言语表达简单叠词、问答不能、双眼追视尚可，四肢肌张力偏低(4级)，四肢协调性级精细动作欠佳，双手可主动抓握但灵活性较差，独站欠稳、可室内行走1 m左右、呈宽基底步态、双下肢明显膝过伸、双足轻度外翻。患儿发育里程碑落后，尤其运动及适应性功能落后明显。辅助检查：血常规及生化检查未见异常；头颅核磁共振提示小脑萎缩，其他未见异常。

给予患儿运动疗法、感觉统合疗法、平衡功能训练、作业疗法、手功能训练及足底反射等综合康复治疗1个月后，患儿独立平地行走能力及语言表达能力得以改善(表1，表2)。

2.2 基因检测结果

本次全外显子组测序平均测序深度为110.67×，大于20×目标区域平均覆盖度为99.20%。分析结果提示该患儿基因发生复合杂合变异，NM_003560：c.496dupG (p.Glu166fs*32)及c.2189T>G (p.Met730Arg)，其父携带杂合子变异c.496dupG (p.Glu166fsTer32)，其母携带杂合子变异c.2189T>G (p.Met730Arg)。检索人群分布频率数据库未见上述变异被收录(PM2)。变异p.Glu166fs*32已被报道[6]，为功能缺失型(loss of function, LOF)变异，并可能导致基因功能缺失(PVS1)。变异p.Met730Arg在ClinVar及HGMD等数据库未见报道，属于基因新变异(PM3)。经在线软件预测变异p.Met730Arg可对蛋白结构产生影响(PP3)。经ACMG指南将变异p.Met730Arg评级为临床意义不明，评级证据为PM2+PM3+PP3；将变异p.Glu166fs*32变异评级为可能致病性，评级证据为PVS1+PM2。Sanger测序证实变异的存在(图1)。

表1 发育评估(Gesell量表)

Developmental Quotient，DQ：发育商

表2 粗大运动评估(GMFM-88评估)

2.3 变异保守性与蛋白结构分析结果

通过对不同物种间氨基酸序列的同源比对结果提示基因编码蛋白166Glu及730Met位点保持高度同源(图2A)。蛋白结构模拟分析野生型结构730Met位于α-螺旋结构，与周围残疾无相互作用，但p.Met730Arg变异发生后与Asp733形成盐桥以及与Val701形成氢键，这可能使局部结构刚性增强而引起稳定性降低，进而影响蛋白功能(图2B)。

图1 该患儿及其父母基因检测结果

基因结果提示患儿基因发生复合杂合变异，NM_003560: c.496dupG (p.Glu166fs*32)及c.2189T>G (p.Met730Arg)，其父携带c.496dupG (p.Glu166fs*32)杂合子变异，其母携带c.2189T>G (p.Met730Arg)杂合子变异，Sanger测序证实变异的存在。

图2 多物种保守性与蛋白结构预测分析结果

A：PLA2G6蛋白166E与730M氨基酸在不同物种间具有保守性；B：蛋白结构模型分析。野生型Met730未比周围残基产生作用，当p.Met730Arg变异发生后，预测Arg730的胍基分别与Asp733形成盐桥(粉红色虚线)，以及与Val701形成氢键(黄色虚线)。

2.4 变异蛋白体外表达结果

为进一步分析变异p.Met730Arg有害性，体外WB实验结果表明PLA2G6-WT组及PLA2G6-MUT组均存在蛋白表达，但PLA2G6-MUT组相比较PLA2G6-WT组蛋白表达量降低约58.3% (<0.001)。这表明变异p.Met730Arg可导致体外细胞蛋白表达量降低(图3)。

3 讨论

婴儿神经轴索营养不良(INAD)，也称为神经退行性脑铁积累症2A型(NBIA2A，OMIM#256600)，是一种罕见的常染色体隐性遗传神经退行性疾病[2]。目前已报道中国人群INAD患者数量不足50例，发病中位数约为1岁3月龄，主要表现为早期肌张力降低，并可快速进展为精神运动发育倒退、小脑萎缩等[4,6～15]。在疾病终末期可能会出现严重痉挛状态或进行性认知障碍等严重表现，通常在10岁前死亡[2,16,17]。本例患儿6月龄前无异常表现，但7月龄时父母发现其四肢无力，后逐步出现抓握灵活性差、独站欠稳定、步态异常及语言发育落后等。通过综合性康复训练后该患儿大运动及精细运动功能得到改善，独站稳定时间延长，但行走仍保持宽基底步态。经基因检测结果提示该患儿基因发生复合杂合变异，c.496dupG (p.Glu166fs*32)及c.2189T>G (p.Met730Arg)。前者为LOF变异，曾被报道于1例中国女性INAD患儿，该患儿除与本例相似的运动发育障碍外，还表现出眼球震颤及听力降低症状，但这些表型尚未出现在本例患儿中[6]。本研究根据患儿临床特征及基因检测结果，最终诊断为INAD。

图3 变异蛋白体外表达结果

A：WB电泳图展示；B：WB灰度值统计结果。**<0.001。

基因位于染色体22q13.1区域，编码iPLA2β蛋白，该蛋白由806个氨基酸组成，主要分为N段结构域、锚蛋白重复区域及催化结构域，可水解游离脂肪酸及溶血磷脂而起到维持稳定细胞膜磷脂结构的作用，iPLA2β蛋白功能受损可引起细胞内铁沉积、脂质过氧化反应及线粒体内膜损伤等，并最终导致细胞凋亡[18]。基因缺陷除导致INAD外，还引起其他疾病发生，如ANAD (OMIM#610217)、常染色体隐性遗传帕金森14型(OMIM#612953)及肌张力障碍-帕金森综合征(Dystonia-Parkinsonism, DP)，因此将基因变异相关神经系统变性病统称为PLAN[19]。对于PLAN不同表型的发生机制仍不清楚，这可能与基因不同变异类型或位点有关，相比LOF变异所导致的强致病性特征(如无义变异、移码变异等)，在特殊位点发生错义变异而引起的iPLA2β酶活性改变更应被重视，Engel等[20]研究表明，在INAD患者基因p.Gly638Arg、p.Arg741Trp变异可显著破坏水解游离脂肪酸的酶活性，而DP患者基因p.Arg632Trp、p.Arg741Gln变异则不会显著破坏iPLA2β酶活性，可以看出在Arg741位点上，即便是不同氨基酸改变也会存在表型间差异。因此对于INAD患者发病早且病情严重的特征可能与基因变异导致功能缺失或严重降低有关，而PLAN或其他亚型可能由于iPLA2β酶底物改变而影响功能相关。本例患儿基因发现1个新型变异p.Met730Arg，该变异是否会导致类似Arg741Trp显著破坏酶活性仍需进一步功能验证，但根据蛋白结构模型分析提示该变异蛋白局部结构稳定性可能发生改变，体外功能实验表明变异蛋白表达量较野生型组显著降低。

目前INAD仍无特殊治疗方案，仍以对症支持性治疗为主，本例患儿因表现运动发育迟缓而进行康复训练，虽然短期内取得一定程度的改善，但这仍无法改变INAD病情发展。脑铁沉积可能是包括INAD在内的遗传性NBIA疾病共同病理生理学特征，因此将脑铁沉积作为药物靶点可能是治疗NBIA病情进展的策略之一，其中铁螯合疗法因可减少细胞铁元素负荷而减缓神经退行性变性，并已在多种神经退行性疾病中发挥重要作用[21]。其他治疗策略，如手术干预在内等多种方法已在多例NBIA患儿中进行并取得一定改善，但这仍局限于对症性治疗范畴。通过腺相关病毒载体介导的基因替代疗法可能会恢复变异导致功能丧失的蛋白表达，目前已经有相关研究通过构建INAD小鼠模型并应用基因疗法成功改善运动功能以及神经病理学特征[3,22,23]。

总之，本研究对1例主要表现为精神运动发育迟缓及小脑萎缩患儿进行报道，通过综合性康复治疗后运动功能得到改善。基因检测结果提示该患儿基因发生复合杂合变异，包括一个新型变异p.Met730Arg，根据该患儿临床特征及基因结果诊断为INAD。本文旨在提示临床医生对于早期出现认知障碍、精神运动发育倒退以及轴性肌张力障碍的患儿，应考虑INAD可能。通过基因检测对疾病进行精准诊断，这不仅可制定个体化治疗及护理方案，而且也为评估家庭再生育的复发风险提供数据支持。

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Diagnosis, treatment and genetic analysis of a child with infantile neuroaxonal dystrophy

Weida Gong, Gang Tao, Tiantian Zhao, Yue Yang, Hong Ji

Infantile neuroaxonal dystrophy (INAD) is a rare autosomal recessive neurodegenerative disease characterized by early hypotonia, and rapid progression to psychomotor development regression, pyramidal tract positivity, and spastic quadriplegia. In this report, we describe a Chinese patient with INAD who presented with hypotonia, delayed motor and language development, and subsequently improved with rehabilitation training. Genetic testing revealed that the patient had compound heterozygousgene variants, with the heterozygous c.496dupG (p.Glu166fsTer32) variant inherited from her father and the heterozygous c.2189T>G (p.Met730Arg) variant inherited from her mother. The p.Met730Arg was a novel variant. The protein structure predicts that the structural stability of the mutant protein may change, and theexperimental results show that the expression of the mutant protein decrease. This study enriches thegene mutation spectrum, and improves the clinicians’ diagnostic awareness of INAD.

infantile neuroaxonal dystrophy (INAD); PLA2G6; rehabilitation

2023-02-15;

2023-04-27;

2023-05-04

宫为大，本科，副主任医师，研究方向：神经发育障碍性疾病。E-mail: gongweida1@126.com

纪红，本科，主任医师，研究方向：神经发育障碍性疾病。E-mail: 82872366@qq.com

10.16288/j.yczz.23-034

(责任编委: 许琪)