大曲酶系的研究现状及展望

翁 鹏，张建敏，彭志云，郑 佳，，3，赵 东，，3*

(1.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 643002；2.宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾 644000；3.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644000)

大曲是以小麦为主，配以豌豆、大麦等原料制成的砖块状曲块[1]，其制作过程分为三个阶段，物料被粉碎、混合和压制定型，在特定的温湿度下进行培曲管理，最后进入曲库进行进一步的干燥和陈化[2]。白酒香型众多，用于酿造酒的曲同样多种多样，白酒大曲按香型可分为浓香型大曲、酱香型大曲、清香型大曲；按制曲温度可分为高温大曲、中温大曲和低温大曲；按工艺可分为传统大曲、纯种大曲和强化大曲[3]。作为白酒发酵剂，大曲在白酒酿造中起到提供菌源、糖化发酵、投粮和生香四大作用。在培养过程中，环境微生物自然富集到大曲上，如五粮液包包曲独特的包包造型，便是典型的微生物收集器，有利于有益微生物的生长，培养完成并通过一定时间的储存后，可为白酒的发酵提供丰富的菌系、酶系，保证白酒的稳定生产。现在对糖化和发酵作用了解太过笼统，还停留在糖化力、液化力等宏观层次的研究，应该进一步从微观即糖化酶、液化酶以及其他酶之间的协同作用入手分析，找出起主要作用的单个酶或组合酶。大曲所含酶系丰富，主要包括淀粉酶类、纤维素酶类、蛋白酶类、脂肪酶、单宁酶和果胶酶等[3]。曲中酶类主要是微生物代谢或次级代谢产生，发酵过程中的微生物群落对水分、温度和酸度的变化非常敏感，因此发酵过程中的理化性质可影响微生物代谢从而影响酶类的产生，但理化性质与大曲酶系并无直接关联性。质量不一致的大曲，会增加生产成本和降低发酵效率，影响白酒的生产过程。大曲质量不一可能是由微生物群落分泌的酶系种类、数量差异较大引起的，随着现代生物技术的发展[4]，对大曲酶系的有更多直观的研究，本文将对白酒大曲酶系的研究做出概述。

1 大曲酶系组成

酶是由活细胞产生，具有催化功能的蛋白质[5]。一切微生物的生命活动都离不开酶，大曲及酿酒培养各种微生物的目的，就是利用微生物产生的酶系进行庞大、复杂的生化反应。大曲中的酶根据催化功能可分为糖化酶、液化酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、酯化酶、漆酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、单宁酶、植酸酶、果胶酶等[1]。

1.1 液化酶

液化酶又称α-淀粉酶（EC3.2.1.1），主要作用是切断淀粉分子内部的α-1,4-葡萄糖苷键，将淀粉水解成糊精和小分子糖，使黏度下降，提高发酵过程中的糖化效率，在70 ℃左右活性较高[6]。液化酶主要来源于枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉[7]。为了提高实际酿造中的出酒率，筛选高产液化酶菌已经成为一种趋势。刘延波等[8]从赊店老酒大曲中筛选出了1 株耐高温的根霉菌B8，在最适条件下，该菌产的液化酶和糖化酶活力分别为41.57 U/g 和162.38 U/g；陈阔[9]从邵阳地区大曲中筛选出WB4、WB9、WB13 3 株产淀粉酶菌株，其中WB4 在酸性环境中可产酶达2.877 U/mL，这一研究使得酿酒生产中可直接添加此菌，使液化力增高，有望提高白酒产量。

1.2 糖化酶

糖化酶又称γ-淀粉酶或葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），主要作用于淀粉非还原性末端的α-1,4-葡萄糖苷键，可将淀粉以及液化酶生成的糊精水解成葡萄糖[10]。主要来源于黑曲霉、根霉、拟内孢霉、红曲霉[11]。值得注意的是，真菌α-淀粉酶也可生成少量葡萄糖[12]。范斌强[13]在包包曲中添加黑茶菌，促进了霉菌生长，抑制了细菌和酵母菌生长，显著提高了糖化酶活力，添加20%黑茶菌时，糖化酶活力提高了12%左右。往酒曲中添加适当的霉菌，能提高酒曲的糖化力，同时风味物质的量也会受到影响[14]，控制好酒曲中霉菌的量，使产酒量与风味物质达到平衡，将会是下一个目标。

1.3 蛋白酶

蛋白酶[15]是水解蛋白质肽键的酶，根据作用pH 值的不同可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶。在酿酒过程中，蛋白质在蛋白酶的作用下，生成游离氨基酸，继而生成白酒众多风味物质的一部分。酸性蛋白酶主要由酶菌产生，如青霉、根霉和曲霉，少部分细菌也能产酸性蛋白酶[11]。李学思[16]以产蛋白酶活达114.8 U/mL 的菌株MSPN-11 进行紫外诱变得到高产蛋白酶菌株MSPR8，酶活相比前者提高了26.38 %；冯利芳[17]从清香型低温大曲中分离出一株产中性蛋白酶的短小芽孢杆菌GF-6，所产中性蛋白酶最适温度为50 ℃，最适pH7，在此条件下酶活达到202.7 U；王芙蓉[18]从酱香大曲中筛选出1 株高产蛋白酶的高温放线菌GW2，在45 ℃、pH6.5、培养5 d 的优化条件下，该菌产酶提高了0.2 倍，可达214.99 U/g。经证实，在液态大曲酒发酵过程中加入适量酸性蛋白酶可有效降低高级醇含量[19]，有助于液态发酵的实现，在微观层面上，黄蓉[20]将酸性蛋白酶基因定点整合到酿酒酵母的基因位点，获得的重组菌株可实现酸性蛋白酶利用与酒精发酵的同步进行，使酒精发酵效率得到极大提升。

1.4 纤维素酶

纤维素酶（EC3.2.1.4）不是单一的一种酶，而是起协同作用的多组分酶系，包含C1酶（外切β-葡聚糖酶）、Cx 酶（内切β-葡聚糖酶）和β 葡糖苷酶（β-葡萄糖苷酶）。在分解纤维素的过程中C1 酶首先破坏纤维素的晶体结构，接着Cx 酶作用于β-1，4-糖苷键，最后经β葡糖苷酶作用生成葡萄糖。纤维素酶在酿造过程中起着重要作用，一方面它将酿造原料高粱、玉米中的纤维素转化为可发酵糖，另一方面，破坏原料中的细胞壁，使胞内淀粉释放，更易于淀粉酶作用[21]。酿造过程中的纤维素酶主要来源于木霉、曲霉、根霉和青霉[22]。罗明有[23]从浓香型白酒糟醅中筛选出了产纤维素酶的酵母菌株S533Y-36，在pH5.8、32 ℃的条件下培养36 h，酶活为1.84 U/mL。比起酵母菌株，大曲中芽孢杆菌产纤维素酶的能力明显更强，龚丽琼[24]从高温大曲中筛选出了产纤维素酶的芽孢杆菌，经优化后酶活达1643.27 U/mL；刘延波等[25]从大曲中分离出了高产纤维素酶的枯草芽孢杆菌，在其最佳产酶条件（接种量4 %、培养3 d、pH4）下，产纤维素酶活力高达1014 U/mL；阳刚[26]发现提升纤维素酶活力使白酒糟的降解率提高了70 %，有助于对白酒糟进行更高效的利用。纤维素酶还能降低杂醇油以及醛类物质含量[27]，使所产酒的风味、口感更佳。

1.5 木聚糖酶

木聚糖酶（EC3.2.1.8）也称半纤维素酶，是可将木聚糖降解为低聚糖和木糖的一组酶的总称，主要包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素[28]。由于酿酒原料淀粉外层含有半纤维素，木聚糖酶协同纤维素酶破坏酿酒粮食细胞结构，释放淀粉、蛋白质等，从一定程度上提高了淀粉酶活力[29]。酸性木聚糖酶的最适pH 值为3.5～6.0,适宜温度为40～60 ℃。徐曼等[28]进行白酒酿造实验，发现添加木聚糖酶组的酒度是对照组的130.47%，且实验组的残糖含量仅为对照组的7.4%。

1.6 单宁酶

单宁酶又称鞣酸酶或单宁酯酰水解酶，可破坏单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖[30]。在发酵中，单宁酶将单宁降解成白酒风味物质，且不同单宁酶可使单宁降解为不同的风味物质[31]，主要来源于黑曲霉、米曲霉和黄曲霉[32]。薛江林等[33]以酶制剂澄清法解决红茅烧酒的沉淀问题，以控制变量法分别探究了支链淀粉酶、中心蛋白酶、糖化酶以及单宁酶的最佳添加量，发现添加0.006%单宁酶的澄清效果最好。

1.7 果胶酶

果胶酯是能够分解果胶物质的酶的总称[34]，包括原果胶酶（PG，EC3.2.1.15）、果胶酯酶（PE，EC3.1.1.11）、果胶水解酶（PH）和果胶裂解酶（PL，EC4.2.2.10），主要作用就是将果胶质中的糖苷键分解，使果胶转化成半乳糖醛酸[35]。果胶是植物细胞壁的重要组成部分，所以果胶酶能破坏酿造原料细胞壁，促进胞内淀粉分子的释放，同时具有一定澄清液体的作用，有实验表明，超过50 ℃后，果胶酶活性会逐步降低[36]。周姝颖等[37]从酒曲中筛选出了一株低产果胶酯酶的解淀粉芽孢杆菌，接种此菌株制作强化酒曲，实验组所得白酒中的甲醇含量显著低于对照组，且接种量为3%时，甲醇含量最低，与对照组相比降低了66.03%。

1.8 脂肪酶

脂肪酶（EC3.1.1.3）属于三酰基甘油酰水解酶类，能将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，具有广泛的工业应用。大曲中的脂肪酶能将原料中的脂肪分解为脂肪酸、甘油、甘油单酯或者甘油二酯，同时分解脂肪所得的能量用于微生物的生长代谢，以上产物能合成丰富白酒风味的类脂[38]。脂肪酶逐渐被运用于白酒酿造副产物。颜晨鳞等[39]在黄水中添加食用酒精和脂肪酶，发现白酒风味酯的浓度增加了近32 倍。研究证明，此酶可重复使用，使得酯类转化率保持不变。李站胜等[40]向白酒丢糟中加入脂肪酶，发现在20 %食用酒精（95 %vol）、1.5 %脂肪酶、20 ℃反应3 d 的条件下，实验组的乙酸乙酯和己酸乙酯比对照组提高16.38 倍和16.67 倍；刘小敏[41]发现脂肪酶tabI 具有合成乳酸乙酯的能力，这为提高白酒中乳酸乙酯提供了可行方向。

2 大曲酶系的研究现状

大曲一般采用开放环境自然发酵制得，品质受环境因素影响较大。在制作发酵剂时，大曲类似于培养基，接种的微生物来自环境，也来自于制作大曲的原料，发酵过程由经验丰富的技术人员操作。因此，生产过程中存在部分不可预测和不可控的因素，造成了大曲乃至于白酒质量的不一致性，差异很大程度是大曲中菌系结构不同造成。细菌群落演替的关键因素是纤维素酶活性、酸度和水分含量等[42]，为更好地控制细菌群落组成提供了可能，从而有可能改善白酒的品质。

2.1 大曲酶系与菌系的研究

大曲酶系是由菌系分泌，有研究表明，在大曲发酵期，微生物数量在升温期最高，高温期下降，降温期有所回升，大曲生物酶量也随着这个规律变化[43]，大曲酶系与菌系息息相关，研究大曲酶系可从大曲菌系入手。大曲中菌类丰富，主要含有细菌、霉菌、酵母菌、放线菌等[1]，张崇军等[44]从浓香包包曲中筛选出产蛋白酶活力高达86.5 U/g 的地衣芽孢杆菌（WLYQ-1.4）；唐贤华等[45]优化了浓香包包曲中耐性益生芽孢杆菌（WLYQ-1），使其高产蛋白酶，在最优条件下产蛋白酶活为87.56 U/mL；马文瑞等[46]从藏曲中分离出的微生物，根霉M12 糖化能力最高，为（1382±77.38）μg/g·min，芽孢杆菌Q4蛋白酶活性最高，为（1035.56±40.09）μg/g·min。将高产蛋白酶菌应用到实际生产中能更好地丰富白酒的风味物质。

黄晓宁等[47]在大曲中筛选乳酸菌时，发现90%所筛乳酸菌株产α-淀粉酶，超过60 %的乳酸菌株产酯酶，且比起单一乳酸菌，在复杂发酵中，经过微生物之间复杂相互作用后的乳酸菌（E48）产酯酶能力最强，酯酶活性高达（63.4±0.4）U/mL。作为白酒发酵过程中的优势菌，乳酸菌通过产生酯酶和代谢产物影响白酒的风味[48]。雷学俊等[49]从包包曲制曲过程中分离出9 个霉菌属，曲中霉菌属丰富。据研究，曲中糖化力主要来自于霉菌如根霉、黑曲霉、红曲酶等。刘延波等[50]从赊店老酒大曲筛选出的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）高产淀粉酶，经过优化后，产酶活力高达（164.37±3.25）U/mL。可将高产酶微生物用于制造强化大曲，提高发酵效率。

2.2 大曲酶系与理化性质的研究

大曲菌系虽能分泌酶系影响物系的理化性质，物系的理化性质也能反过来影响菌系、酶系。将制曲过程中浓香型包包曲曲心、曲皮的总酸、水分等理化性质与曲皮、曲心微生物群落结构的研究结合分析，发现理化性质是影响包包曲微生物的重要因素，造成了曲中微生物数量和分布差异[51]，酶系分布与数量也会因为菌系变化发生改变。水分作为大曲理化性质之一，向来是研究大曲时不可忽视的，大曲中微生物生命活动与诸多酶反应都需要水，张宗舟[52]发现黑曲霉ZM-8 大曲的含水量会对酶系酶活产生影响，且控制含水量为49%～50%，室温为25℃，培养40 h，酶系酶活显著增大，这表示曲中水分变化会影响酶系的变化，具体机理有待研究。大曲总酸变化会引起pH 值变化，微生物及其数量种类受pH 值变化影响，其分泌的酶系也随之改变。

2.3 大曲酶系在曲块中的分布

大曲中的酶系来源于微生物群落代谢，微生物群落生长繁殖取决于曲块通气情况、温度、水分等理化因素，所以研究大曲酶系的分布情况要从理化性质入手。研究大曲不同部位酶系的动态变化，发现在发酵过程中曲外层菌系数量高于曲心[53]，比起曲心，曲皮接触了更多的氧气，更有利于微生物群落生长，所以曲心酶活力一般都低于曲皮酶活力。大曲发酵初期，温度从20 ℃逐渐上升到40 ℃，这一温度范围有利于微生物群落生长繁殖，酶系随着微生物大量生长而被分泌，曲块中总酶活达到最大。进入高温期，微生物大量死亡，曲块中的酶活力急剧下降。研究表明，十月制作大曲的酶活普遍高于六月制作的大曲[54]，造成这一差异的原因是六月环境温度高，使得发酵大曲升温过快，曲块内微生物生长不充分，产酶也不充分。

2.4 大曲酶系的提取与测定

大曲酶活测定前处理步骤——大曲酶蛋白提取的成功与否决定后续酶活力检测的最终结果，对大曲中胞外酶蛋白提取条件[55]进行研究，发现料液比对酶蛋白提取更加重要，提取时间达到1 h 后再增加对酶蛋白提取影响甚微，还发现曲中纤维素酶主要来自孢子休眠体的微生物，除了纤维素酶在提取时需要对水浸液进行超声波粉碎，糖化酶等胞外酶[56]大多不需要进行特别处理，在适宜pH 值水溶液浸提即可。范伟业等[57]用tris-HCL 提取包包曲中的酶蛋白，发现在pH7、浸提2 h、料液比为1∶5 的条件下，提取酶蛋白效果最好，蛋白浓度为285.68 μg/mL，经过两次离心得到粗酶液，能检测出大曲中多种酶活。王玉霞等[58]用pH4.6 的乙酸-乙酸钠缓冲液在4 ℃条件下过夜浸提大曲粉，料液比为1∶2，最后将浸提液过滤、离心得到粗酶液，所得粗酶液能检测出α-淀粉酶、丹宁酶、木聚糖酶和脂肪酶酶活力。

在对大曲酶系的研究中，最直接的就是测定酶系酶活，找出最优酶活检测方法测定各类酶活至关重要。刘璐[59]使用传统比色法和分光光度法测定大曲液化酶活力，结果表明，不管是时间还是测定准确度，分光光度法都优于传统比色法。除了分光光度法，有条件也可采取非常规检测分析大曲酶系酶活力，张强等[60]利用HPLC 分析大曲中液化酶和糖化酶活力，发现与常规方法所测酶活力一致，酶联免疫法也被用于大曲酯化酶活测定[61]，其准确性也可得到保障。为了使酶活测定更快捷，各类酶活测试盒被广泛推广，极大地提高了酶活测定效率。

3 展望

白酒大曲微生物群落演替的一般规律是目前白酒研究的热点，大曲酶系与微生物群落、理化性质的关系密不可分，从酶系角度分析大曲发酵过程中影响其质量的因素，通过大曲菌系分泌的各种酶对各种类型大曲糖化发酵机理进行探究，有利于将大曲酶系进行利用，筛选出相关功能菌，为大曲发酵以及功能菌的应用提供理论基础。期望未来能对大曲中如漆酶、植酸酶等少见酶类进行探究，进一步丰富酶系研究，找出白酒发酵中的关键酶，解析固态酿造原理。