超高b值弥散加权成像评估促红细胞生成素治疗肾缺血再灌注损伤效果

伏庆琳,余安定,宗钦伶,潘 靓,邢 伟,陈 杰

(苏州大学附属第三医院放射科,江苏 常州 213003)

肾缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)常见于休克、肾移植及心血管手术后,是造成急性肾损伤的重要原因之一;而红细胞生成素(erythropoietin, EPO)对肾脏及中枢神经系统等具有一定保护作用[1-2]。 IRI所致肾脏浓缩功能下降与肾小管上皮细胞水通道蛋白(aquaporin, AQP)改变有关[3]。超高b值弥散加权成像(ultra-high b value diffusion weighted imaging, HBV-DWI)可通过拟合一系列超高b值获得水分子跨膜转运信息,间接反映肾IRI后细胞膜AQP表达水平及其功能[4]。本研究通过比较兔肾IRI模型经EPO治疗前后超高b值表观弥散系数(ultra-high apparent diffusion coefficient, ADCuh)的差异,观察HBV-DWI用于监测EPO治疗兔肾IRI效果的价值。

1 材料与方法

1.1 建立动物模型 18只2～3月龄健康新西兰大白兔,体质量2.0～2.5 kg,由苏州大学动物中心提供;将其随机均分为IRI+EPO组、IRI组及对照组,分笼饲养,室温22～25℃,自由采食与饮水。建模前12 h停饲、停饮,记录体质量。肌内注射3%戊巴比妥钠(1 ml/kg体质量)诱导麻醉,吸入异氟烷(2%～3%异氟烷与100%氧气混合,3 L/min)维持麻醉。将实验兔以右侧卧位保定于手术台,常规备皮、消毒左肾区,暴露左肾,以无创性动脉夹夹闭左肾蒂,以肾脏由鲜红色转为暗红色为夹闭成功[5];60 min后对IRI+EPO组松开动脉夹并立即腹腔注射EPO(3 000 U/kg体质量),之后关闭腹腔;对IRI组于松开动脉夹后立即腹腔注射等量生理盐水;对对照组于暴露左肾60 min后经腹腔注射等量生理盐水。本研究经院伦理委员会批准[编号:(2019)科第008号]。

1.2 MR检查 于建模后48 h采用GE Discovery Silent 3.0T MR仪及12通道相控阵柔性线圈采集兔常规T2WI及多b值DWI。扫描前停饲、停饮12 h,吸入异氟烷麻醉动物后,以左侧卧位保定,使轴位扫描定位线中心位于左肾门水平并垂直于左肾长轴;参数:快速自旋回波T2WI,TR 1 807 ms,TE 85 ms,FOV 14 cm×14 cm,层厚4.0mm,层间距1.0 mm,矩阵256×224,带宽31.25 Hz,扫描时间1.52 min;平面回波多b值DWI,TR 2 000 ms,TE 112 ms,FOV 11 cm×11 cm,层厚4.0 mm,层间距0.3 mm,矩阵64×32,带宽125 Hz,b值=0、50、100、150、200、300、500、800、1 000、1 300、1 500、1 700、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000、4 500 s/mm2,扫描时间6.22 min。

将DWI数据传送至GE AW 4.7工作站,以TRI ADC模型软件拟合b≥1 700 s/mm2超高b值至公式(1),经计算得到ADCuh伪彩图:

(1)

式中,S为采用对应b值时的DWI信号强度,S0为b值为0时的信号强度。

由2名具有5年以上工作经验的影像科医师参照T2WI于轴位DWI左肾门层面避开出血及伪影区域,分别沿皮质(cortex, CO)和外髓(outer medulla, OM)手动勾画ROI并将其映射至ADCuh伪彩图上,获得肾脏CO、OM的ADCuh。

1.3 病理学检查 以空气栓塞法处死动物,摘取左肾并于肾门层面进行横切,行HE染色,观察兔肾脏病理改变;行AQP免疫组织化学染色,于400倍显微镜下随机选取CO、OM层各5个视野,利用Image-Pro Plus 6.0软件量化AQP-1、AQP-2阳性表达部位,测量其累积光密度(integral optical density, IOD)。

1.4 统计学分析 采用SPSS 25.0统计分析软件。以组内相关系数(intra-class correlation coefficient, ICC)评价观察者间测量结果的一致性:ICC<0.4为一致性差,0.4≤ICC≤0.75为一致性中等,ICC>0.75为一致性较好。以±s表示服从正态分布的计量资料,采用单因素方差分析比较3组肾CO及OM的ADCuh、AQP-1及AQP-2 IOD值差异,以LSD-t检验行两两比较。采用Pearson相关分析评估兔左肾CO及OM的ADCuh与免疫组织化学指标的相关性:|r|<0.5为弱相关,0.5≤|r|≤0.75为强相关,|r|>0.75为极强相关。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔CO及OM ADCuh变化 MR T2WI示各组左肾皮髓质分界尚清晰;DWI图示各组左肾CO均呈高信号、OM均呈低信号,皮髓质分界尚清晰;ADCuh伪彩图示对照组左肾皮髓质以红色为主,IRI组左肾皮髓质由红色逐渐变黄变绿、颜色变浅,IRI+EPO组左肾皮髓质颜色逐渐向红色恢复、颜色加深(图1)。2名医师测量左肾CO ADCuh的ICC为0.834[95%CI(0.610,0.934)],测量左肾OM ADCuh的ICC为0.884[95%CI(0.716,0.955)],观察者间一致性较好,后续取均值进行分析。IRI+EPO组及IRI组左肾CO、OM的ADCuh均低于对照组(P均<0.05);IRI+EPO组左肾CO、OM的ADCuh高于IRI组(P均<0.05),见表1。

图1 各组兔左肾T2WI、DWI及ADCuh伪彩图

表1 各组兔左肾CO及OM ADcuh比较(×10-3 mm2/s)

2.2 病理学 光镜下见IRI组肾小管上皮细胞大量坏死、凋亡,刷状缘消失,肾小管管腔内见红细胞管型及蛋白质管型积聚,肾间质内见炎细胞浸润及点片状出血灶;IRI+EPO组肾小管坏死细胞和管型较IRI组明显减少,间质充血、出血较IRI组明显减轻。对照组肾小管上皮细胞排列整齐、间质结构清晰,未见炎症细胞浸润。见图2。

图2 各组兔左肾病理改变(HE,×400) A.IRI组; B.IRI+EPO组; C.对照组

免疫组织化学染色结果显示,实验兔左肾CO及OM的AQP-1、AQP-2均以对照组最强,IRI+EPO组次之,IRI组最弱(图3)。IRI+EPO组及IRI组左肾CO及OM的AQP-1、AQP-2 IOD值均低于对照组(P均<0.05);IRI+EPO组左肾CO的AQP-1 IOD值及OM的AQP-1、AQP-2 IOD值均高于IRI组(P均<0.05)。见表2。

图3 各组兔左肾CO及OM的AQP-1、AQP-2免疫组织化学染色图(×400)

表2 各组兔左肾CO及OM的AQP-1、AQP-2 IOD值比较(×104)

2.3 相关性分析 兔左肾CO的ADCuh与AQP-1 IOD值呈极强正相关(r=0.756,P<0.01),与AQP-2 IOD值呈极强正相关(r=0.819,P<0.01);左肾OM的ADCuh与AQP-1 IOD值呈强正相关(r=0.720,P=0.001),与AQP-2 IOD值呈极强正相关(r=0.848,P<0.01)。

3 讨论

肾脏为高灌注器官,其皮髓质交界区血流分布不均,肾小管逆流倍增效应及近端小管和髓襻升支粗段的钠离子重吸收机制导致耗氧量增加[6-7],极易发生IRI,使肾脏浓缩和重吸收功能下降,引发水、电解质紊乱。动物实验[8]结果表明,缺血60 min后,即使实现再灌注,兔肾已受到严重不可逆损伤。

近年功能MRI评估肾IRI已取得一定成果。MR血氧水平依赖成像可通过反映组织氧合水平而间接评价肾IRI[9],但无法准确区分脱氧血红蛋白浓度的变化是由灌注还是组织代谢所致,不能绝对量化肾脏氧环境。动脉自旋标记成像以水质子作为内源性示踪剂,可无创反映肾脏血流灌注水平,但其信噪比较低。动态对比增强MRI可反映肾脏皮髓质血流变化情况,但需要使用对比剂。

HBV-DWI在DWI基础上引入超高b值并拟合至三指数模型中而获得水分子跨膜转运信息,即ADCuh[10],AQP存在于多种细胞膜表面,可介导自由水快速被动跨膜转运。肾脏调节机体水平衡时,AQP-1和AQP-2发挥主要作用[11]。HBV-DWI的b值越高,血流灌注及水分子自由扩散引起的信号衰减越明显,检测结果也越接近AQP转运的水分子信息[12]。WANG等[13]认为HBV-DWI可评估肾AQP表达,以早期评估肾损伤。

IRI早期,缺血细胞内ATP水平迅速下降、H+增加,酸中毒引起细胞水肿;再灌注后,白细胞分泌大量趋化因子和细胞因子,触发炎症级联反应,造成细胞损伤、诱导细胞凋亡;同时,大量氧自由基被释放及钙超载等进一步引起组织损伤,其共同作用使位于肾小管上皮细胞及集合管主细胞膜上的AQP明显减少[14]。除促红细胞生成外,EPO还可通过抗炎、抗凋亡及调节AQP表达等机制对机体多种组织器官起到保护作用[1,15]。GONG等[3]通过动物实验发现于缺血前给予EPO能有效防止IRI诱导的AQP表达下调,改善肾小管浓缩功能。本研究IRI组左肾CO及OM的ADCuh均较对照组明显降低,与AQP变化趋势一致;IRI+EPO组建模后48 h肾脏CO的AQP-1 IOD值及OM的AQP-1、AQP-2 IOD值均高于IRI组,ADCuh变化趋势也与其一致,提示EPO干预后兔AQP-1、AQP-2表达较IRI组有所恢复,而HBV-MRI可无创反映肾IRI后AQP表达变化。本研究IRI+EPO组与IRI组左肾CO的AQP-2的表达量无明显差异,可能与样本量小、AQP-2在肾脏皮髓质分布差异有关。

EPO可通过抑制缺血性损伤时合成一氧化氮而影响抗利尿激素分泌,以防止AQP-2表达下调[16]。既往研究[17]发现再灌注24 h内肾皮质小管周围成纤维细胞受损使合成EPO明显减少,而EPO受体表达则维持在良好水平;由此推测,外源性EPO可减轻肾脏负担的原因还可能与其抗炎、抗凋亡及诱导血红素加氧酶1的表达对抗氧化应激等机制有关[18]。本研究相关性分析结果表明,肾ADCuh与AQP-1、AQP-2表达均呈正相关,进一步提示ADCuh可在一定程度上反映肾IRI经EPO治疗后AQP变化,进而评估疗效。

本研究的局限性:①样本量小;②仅针对再灌注48 h后,未进一步动态分析不同再灌注时间点ADCuh变化;③EPO合理剂量有待确定。

综上,HBV-MRI可无创反映肾IRI兔经EPO治疗后AQP表达变化,进而监测其治疗效果。