采用主成分分析不同来源蜂蜜理化品质和抗氧化品质特性

王丽，李淑荣，句荣辉，杨洋，公丽艳

1.北京农业职业学院食品与生物工程系（北京 102442）；2.沈阳师范大学粮食学院（沈阳 110034）

蜂蜜是蜜蜂从花蜜或蜜露中获得的天然产物，自古以来具有药食两用珍贵物质的美誉，不同植物来源直接影响蜂蜜的品质特性[1]。天然蜂蜜具有抗菌特性，可用于治疗感染的伤口[2]。为满足消费者的需求，许多国家天然蜂蜜需求量不断增长，而如何区分蜂蜜的种类及来源是多数消费者关注的焦点。研究学者通过不同的方法区分蜂蜜的来源及真实性，如糖标记物[3]、脯氨酸含量[4]、抗氧化性等[5-6]。脯氨酸含量在不同的蜂蜜中差异很大，可用于测量总氨基酸含量水平。Dominguez等[4]报道自由基清除活性与脯氨酸含量呈正相关。研究发现，天然蜂蜜具有独特的化学成分，如天然蜂蜜比加工过的蜂蜜含有更高的淀粉酶值[7]；天然蜂蜜具有较高的脯氨酸含量、总酚含量和抗氧化活性[8-9]。然而，这些特性受条件、产地、工艺方法和添加剂等因素的影响[9]，往往降低了蜂蜜分类中参数的有效性。

近年来，天然蜂蜜、加工蜂蜜和蜂蜜替代品的市场份额不断增加。但不同样本中数据集相对复杂，导致很难通过单独某种物质含量的多少判断蜂蜜的来源和质量。PCA方法是一种多变量建模和降维技术，能够管理和解释大型数据集，被有效用于脂肪酸[10]、肉类[11]和辐照食品[12]的区分与鉴别研究中。Brodnjk-Vončina等[13]应用PCA对各种植物油进行分析，结果显示花生中脂肪酸在PCA评分图PC1-PC2中存在聚类，油酸和亚油酸之间存在近乎完美的负相关（r=-0.970）。国外对蜂蜜的理化和抗氧化能力进行一些研究[6,14]；我国还没有详细的采用PCA方法分析蜂蜜的理化和抗氧化能力。通过分析天然蜂蜜和商品蜂蜜品质特性指标之间的关系，旨在揭示蜂蜜主要品质特性，构建天然蜂蜜和商品蜂蜜的区分方法。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用样品采集于专业合作社及当地超市典型蜂蜜样品（如表1所示）。所有样品均存放在4 ℃冰箱中备用。

表1 蜂蜜理化品质的描述性分析

1.2 试剂与仪器

氢氧化钠、碳酸钠等所有使用的化学品和试剂均为分析纯均购自索莱宝（北京，中国）。没食子酸、芦丁、葡萄糖、槲皮素和脯氨酸（均购自美国Sigma公司）。

分光光度计（UV-2550，日本岛津）；色度计（CR-400，日本岛津）。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

5 g蜂蜜样品用10 mL 20 ℃蒸馏水溶解，离心过滤定容至25 mL备用。

1.3.2 基本化学成分分析

水分测定参考GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》；酸度测定参考GB 5009.239—2016《食品中酸度的测定》；果糖、葡萄糖测定参考GB 5009.8—2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》；淀粉酶值测定参考GB/T 18932.16—2003《蜂蜜中淀粉酶值的测定》；羟基甲基糠醛（HMF）测定参考GB/T 18932.18—2003《蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法》。均采用国标法测定。

1.3.3 颜色分析

采用色差计测定。

1.3.4 脯氨酸含量

采用茚三酮法[15]测定。

1.3.5 总酚含量

采用福林酚法[16]测定。

1.3.6 总黄酮含量

采用槲皮素标准曲线法[17]测定。

1.3.7 总抗氧化活性

采用芦丁标准曲线法[16]测定。

1.3.8 DPPH自由基清除活性

采用DPPH法[18]测定。

1.3.9 超氧阴离子自由基清除活性

采用邻苯三酚法[19]测定。

1.4 数据分析

所有数据均以平均数±标准差表示。显著性分析、相关性分析和主成分分析通过SPSS软件完成。

2 结果与讨论

2.1 基本化学成分分析

测定了10种蜂蜜的水分、酸度、果糖、葡萄糖、淀粉酶值和羟基甲基糠醛（HMF）（结果未显示）。蜂蜜的含水量取决于环境条件、蜂蜜收获期的操作及制造商的加工条件。蜂蜜中的水分与储存期间的发酵情况密切相关。试验所有蜂蜜样品中的含水率为16.41%~19.56%，低于国际蜂蜜质量标准（≤20%）[20]。该结果与已报道不同类型蜂蜜的研究结果（13.63%~20.60%）[8]一致。蜂蜜的酸度主要是由于有机酸的存在，主要是葡萄糖酸与其相应的内酯及无机离子的平衡，如磷酸盐、硫酸盐和氯化物[21]。试验中蜂蜜样品的酸度范围为0.12 °T~0.39 °T，平均值为0.21 °T。

蜂蜜主要由果糖和葡萄糖组成。其中蜂蜜样品中果糖和葡萄糖含量分别为36.69%~45.74%和29.40%~33.53%，所有蜂蜜样品中果糖含量均高于葡萄糖，这与Dagdeviren等[8]的报道一致。果糖和葡萄糖的总含量占蜂蜜质量的60%以上，符合GB 14963—2011对蜂蜜质量的规定。

淀粉酶值是评价蜂蜜新鲜度的重要指标。结果显示P4的淀粉酶值最高[18.1 mL/（g·h）]，C3的淀粉酶值最低[2.57 mL/（g·h）]，所有天然蜂蜜的淀粉酶值均大于12 mL/（g·h），高于我国蜂蜜标准中要求淀粉酶值[4 mL/（g·h）]。市售蜂蜜的淀粉酶值为2.57~3.12 mL/（g·h），低于国家蜂蜜标准，试验结果与Seow等[7]结果一致。淀粉酶值是天然蜂蜜中的主要成分，而淀粉酶值会受温度等因素影响。蜂蜜中的HMF含量常用于分析确定蜂蜜的质量，与蜂蜜所处的不同美拉德反应阶段、贮存时间有关[22]。结果显示不同蜂蜜样品中HMF含量有显著差异。天然蜂蜜中HMF含量低于5 mg/kg，而商品蜂蜜中HMF含量在35~50 mg/kg，后者高于我国蜂蜜质量标准（低于40 mg/kg）。

2.2 颜色分析

不同蜂蜜样品中色泽L*、a*、b*分析发现，C1的L*参数平均值最高（65.68），表示亮度大，P1的L*值最低（33.51），颜色偏暗。P2、P4和P5的L*值非常相似，分别为45.86，48.73和47.36。Brand-Williams等[18]根据亮度值将蜂蜜样本分为2组：L*＞50的为浅色蜂蜜和L*≤50的为深色蜂蜜。据此分类，P3、P6、P7、C1、C2、C3可归为浅色蜂蜜组，其他可归为深色蜂蜜组。不同样品a*值的变化范围为-2.18~5.41，b*值的变化范围为9.99~41.94。因此，所有颜色较深的样品显然都含有红色和黄色成分。据报道，深色蜂蜜比浅色蜂蜜含有更多的酚酸衍生物，但黄酮含量较低。也有研究表明，蜂蜜的颜色与其抗氧化能力呈正相关[9]。蜂蜜的颜色是其花卉来源的特征，但加热和贮藏时间也可能会影响蜂蜜的颜色，因此，后续可研究蜂蜜颜色与蜂蜜品质特性之间的关系。

2.3 脯氨酸含量

脯氨酸含量范围为9.10~45.40 mg/kg，平均值为32.15 mg/kg。Dagdeviren等[8]报道过蜂蜜中脯氨酸的类似值。脯氨酸含量最高（P1、P2）和最低（C3）分别来自天然蜂蜜和商品蜂蜜。其中，天然蜂蜜脯氨酸含量为31.20~45.40 mg/kg，平均值为39.40 mg/kg，商品蜂蜜的脯氨酸含量为9.10~23.30 mg/kg，平均值为15.23 mg/kg。前者的脯氨酸含量是后者的2.5倍。这一结果与Dominguez等[4]的发现一致，即天然蜂蜜种含有较高的脯氨酸含量。脯氨酸是天然蜂蜜的主要成分，而脯氨酸非常稳定，一般加工过程不易破坏。试验中的天然蜂蜜中的脯氨酸含量显著高于商品蜂蜜，其原因有待进一步研究。

2.4 总酚含量

酚类成分是影响蜂蜜功能性质的一类重要化合物，具有明显的抗氧化和自由基清除作用[23]。试验中，总酚含量通过没食子酸的标准曲线方程（R2=0.999 4）计算不同样品蜂蜜中总酚含量的变化范围是20.05~34.35 mg GAE/100 g，其平均值为28.71 mg GAE/100 g。Dominguez等[4]调查27个来自布基纳法索的蜂蜜样品总酚含量（32.59~114.75 mg GAE/100 g）高于试验结果。Socha等[24]测定波兰蜂蜜中酚类物质的含量远低于试验中酚类物质的含量（4.46~15.04 mg GAE/100 g）。试验中总酚的平均含量与Beretta等[25]的研究结果（27.86 mg GAE/100 g）一致。蜂蜜样品中总酚含量差异显著，但这些数据不足以区分2种蜂蜜的差异。

2.5 总类黄酮含量

类黄酮是一类具有强大抗氧化性能的植物成分。因此，可通过蜂蜜中总黄酮含量表征蜂蜜的抗氧化性能。通过槲皮素生成的标准曲线方程（R2=0.999 8）分析蜂蜜样品中总黄酮含量为18.07~23.74 mg QE/100 g，平均值为21.27 mg QE/100 g。天然蜂蜜中的总类黄酮含量（22.24 mg QE/100 g）高于市场购买蜂蜜的平均值（19.02 mg QE/100 g）。试验中，蜂蜜的总黄酮含量显著高于天然蜂蜜的报道值[4]，与Sochar等[26]的报道一致。

2.6 总抗氧化活性

用硫氰酸铁法测定蜂蜜的总抗氧化活性，测定脂质过氧化初始阶段产生的过氧化量。不同蜂蜜样品的抗氧化性能依次为C1（840.77 mg/100 g）＞C3（747.48 mg RE/100 g）＞P1（716.38 mg RE/100 g）＞C2（702.91 mg RE/100 g）＞P2（690.47 mg RE/100 g）＞P7（673.37 mg RE/100 g）＞P6（669.74 mg RE/100 g）＞P4（643.82 mg RE/100 g）＞P5（627.24 mg RE/100 g）＞P3（585.26 mg RE/100 g）。结果显示市售蜂蜜样品具有较高的抗氧化活性。总酚和总黄酮含量是蜂蜜抗氧化特性的主要影响因素，2.4和2.5未发现市售蜂蜜和天然蜂蜜间有显著差异，因此需要通过其他数学分析方法进一步分析。

2.7 DPPH自由基清除活性能力

采用有机自由基稳定剂1, 1-二苯基-2-三硝基肼的DPPH法测定自由基清除活性，通常用IC50值表示，以及使DPPH初始浓度降低50%所需的抗氧化剂量。因此，样品的IC50值越低，其抗氧化活性越高[27]。P5的活性最低，IC50值为79.04 mg/mL，显著高于其他样品的IC50值。其他样品的IC50值仅为16.11~40.04 mg/mL。蜂蜜对DPPH自由基的清除能力与Beretta等[25]报道的IC50值基本一致。

2.8 超氧阴离子自由基清除活性

分析结果显示不同蜂蜜的超氧阴离子自由基清除活性存在显著差异。所分析蜂蜜的超氧阴离子自由基清除活性范围为187.48~1 621.24 mg/mL，平均值为469.88 mg/mL。市售蜂蜜IC50较低，为190.54~192.20 mg/mL，天然蜂蜜IC50较高，为187.48~1 621.24 mg/mL。因此，商品蜂蜜的抗氧化能力高于天然蜂蜜，这与其他报道中天然蜂蜜抗氧化能力更高的说法不一致。因此，必须采用新方法评价天然蜂蜜和商品蜂蜜的质量。

2.9 相关性分析

为进一步明确蜂蜜不同品质特性指标之间的关系，采用相关性分析探索不同蜂蜜中15个品质指标的关系，揭示各指标之间的相互作用（具体表格未显示）。结果发现10个样品理化性质之间的相关系数。结果显示，脯氨酸与水分（r=0.851）、淀粉酶值（r=0.834）、总酚含量（r=0.526）、总黄酮含量（r=0.914）、酸度（r=0.816）、HMF（r=-0.924）、果糖（r=-0.937）显著相关。淀粉酶值与总酚含量（r=0.637）和总黄酮含量（r=0.804）呈正相关。总酚含量与总黄酮含量呈正相关（r=0.646）。蜂蜜各成分之间的相互关系与Yücel等[28]的研究结果相似。脯氨酸是蜂蜜最重要的特性之一，与抗氧化活性有显著关系。脯氨酸和总抗氧化性能呈负相关（r=-0.413），这与其他报道相反[28]。

2.10 主成分分析（PCA）

通过相关性分析结果发现，不同蜂蜜的理化特性和抗氧化能力具有显著的相关关系，但很难确定不同蜂蜜整体的品质质量。主成分分析是基于原有蜂蜜品质特性指标，通过降维的方式，将蜂蜜品质指标间建立相关关系模型，可以分析不同蜂蜜品质特性之间的关系。通过主成分分析将蜂蜜中的15个品质指标构建成4个主成分，4个主要成分对样品的理化和抗氧化性能的总变异性有显著影响，第1主成分解释了总变异的58.76%，前2个主成分解释了总变异的72.59%，前3个主成分解释了总变异的82.07%，前4个主成分解释了总变异的88.83%。前4个主成分的特征值大于其余主成分的特征值。这一发现符合PCA的标准。在PCA模型中，第1个成分解释了58.76%的变异（图1 A），其中水分、淀粉酶值、总黄酮含量、脯氨酸、酸度和总酚含量提供较高的正载荷值。果糖和羟甲基糠醛表现出较高的负载荷值。第2个成分解释了13.84%的变异（图1 B），由2个变量（a*，总抗氧化能力）定义，均具有较高的正载荷值。第3个成分解释了9.48%的变异（图1 C），其中葡萄糖、总酚含量、DPPH自由基清除活性和超氧阴离子自由基清除活性具有较高的载荷值。第4个成分解释了6.76%的变异（图1 D），其中的超氧阴离子自由基清除活性具有较高的正载荷值，DPPH自由基清除活性具有负载荷值。PC1和PC2的得分图（图2）将天然蜂蜜和商品蜂蜜分为2个不同的组。结果与各样品的PCA总分一致（表2）。

图1 PCA模型中前4个主成分的载荷值

图2 PC1得分与PC2得分值对不同来源样品分类的影响

表2 不同蜂蜜主成分得分

图2右侧的样品（PC1中较高的正得分值包括淀粉酶值、总黄酮含量、脯氨酸等）对应的是天然蜂蜜样品。图2左侧的样品（PC1中酸度、果糖和HMF得分为负值）对应的是市售样品。因此，天然蜂蜜的淀粉酶值、总黄酮含量和脯氨酸含量较高，其PC1轴为正方向。商品蜂蜜具有较高的酸度，果糖和HMF，符合PC1轴负方向。即天然蜂蜜具有较高的淀粉酶值、总黄酮含量和脯氨酸含量，商品蜂蜜具有较高的酸度、果糖和羟甲基糠醛。PC1-PC2使得样本可以根据它们的来源100%的聚类，没有异常值。通过表2结果可以看出，综合主成分得分排在前7位的为天然蜂蜜样品，后3位的为商品蜂蜜，研究结果显示聚类分析结果与主成分分析结果一致。

3 结论

通过相关性分析和主成分分析天然蜂蜜和市售蜂蜜品质特性的差异及特点。相关性分析结果发现，不同蜂蜜品质指标之间具有显著差异，同时也具有一定相关关系，如市售蜂蜜比天然蜂蜜具有较好的抗氧化性，但很难判断不同蜂蜜的品质特性优良，也无法通过哪些指标判断不同来源的蜂蜜。而PCA可通过降维、建模，进一步判断不同品质特性对蜂蜜整体品质特性的影响。通过PCA建模得出，果糖、淀粉酶值、总黄酮含量、羟甲基糠醛、脯氨酸等品质特性可将不同蜂蜜样品区分开来。总抗氧化能力、DPPH自由基清除活性和超氧阴离子自由基清除活性在PCA模型建立和蜂蜜品质评分上具有简化评价的作用。脯氨酸和羟甲基糠醛是这2类样品的主要区别指标。