青花椒精油柔性脂质体的制备及质量评价

刘艳苓，董红霞，龙泽丽，韩阳，韩静

1.沈阳药科大学制药工程学院（沈阳 110016）；2.沈阳药科大学功能食品与葡萄酒学院（沈阳 110016）；3.沈阳药科大学中药学院（沈阳 110016）

青花椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc，Z.schinifolium）是芸香科花椒属植物中的一种[1]，是我国传统的中药[2]和调味剂[3]，是药食同源的植物[4]。原产于中国南部、孟加拉国、不丹、印度北部等地[5]。《中国药典》中记载花椒是青椒的干燥成熟果皮，具有温中止痛、杀虫止痒的功效[6]。现代药理研究表明，青花椒及其提取物具有抗菌、抗氧化、抗炎镇痛、抗肿瘤和降血糖等药理活性[7]。事实上，花椒作为一种药用植物在亚洲已经被使用数千年，在初级卫生保健中发挥着重要作用[8]。

青花椒精油作为青花椒的主要活性成分，是一种复杂的有机化合物混合物，具有清爽和麻木的味道，是花椒香气和特殊风味的主要来源，也是判断花椒品质的重要依据，具有药辅合一的作用[9]。近年来，从药用植物或草药中提取的天然产物已经成为一种医学界重要补充治疗方法[10]。花椒精油作为一种公认的安全物质[11]，含有许多易降解和高挥发性的生物活性物质[12]。Rashed等[13]通过分离得出，青花椒精油中芳樟醇为主要成分，占57.54%。由此表明，芳樟醇是青花椒精油当中含量最高的成分。但青花椒精油本身存在稳定性差、生物利用度低等问题，因此充分利用青花椒精油促进药物经皮渗透的优点，将其开发成稳定安全的经皮给药制剂具有重要意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

日立Primaide高效液相色谱仪（日本Hitachi公司）；Zetasizer Nano ZS激光粒度测量仪（英国Malvern公司）；ATY124精密电子天平（日本Shimadzu公司）；SHA-BA水浴恒温振荡器（江苏科析仪器有限公司）；Scientz-IID超声波细胞破碎机（宁波新芝生物科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 材料与试剂

青花椒（云南泰瑞农林发展有限公司）；芳樟醇对照品、氢化大豆卵磷脂、泊洛沙姆188（上海麦克林生化科技有限公司）；胆固醇（天津光复精细化工研究所）；1, 2-丙二醇（天津恒兴化学试剂有限公司）；氯仿（天津利安隆博华医药化学有限公司）；甲醇（天津康科德科技有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 青花椒精油的提取

依据2020版《中国药典》第四部中精油测定法（甲法）来提取青花椒精油：称取50 g预处理过的青花椒粗粉加入到1 000 mL烧瓶中，加入数颗沸石，取10倍量超纯水浸泡1 h后，加热微沸4 h，静置10 min，收集青花椒精油。

2.2 青花椒精油纳米柔性脂质体的制备

采用薄膜-超声法制备青花椒精油柔性纳米脂质体，用分析天平分别精密称取一定量的氢化大豆卵磷脂、胆固醇置于10 mL茄形瓶中，加入适量氯仿和甲醇（2∶1，V/V），加热至完全溶解，室温条件下减压蒸馏除去有机溶剂，至瓶壁上出现均匀的干燥脂质薄膜，待有机溶剂完全除去，取下茄形瓶。另将1%（V/V）丙二醇与青花椒精油超声互溶，加入水和表面活性剂，制备成青花椒精油混悬液。在一定温度下，向类脂膜中逐滴加入青花椒精油混悬液，搅拌水化，取出后用超声波细胞破碎仪冰水浴超声，即得到青花椒精油柔性脂质体。

2.3 精油中芳樟醇含量方法学的建立

2.3.1 色谱条件

色谱柱：日立Primaide高效液相色谱仪 ODS C18液相色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（50︰50，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：205 nm，柱温30 ℃；进样量：10 μL[14]。

2.3.2 线性关系

精确称取芳樟醇对照品，用乙腈稀释成11.32，22.64，45.28，67.92，90.56，113.20和566.50 μg/mL标准稀释溶液。以芳樟醇浓度（X）对峰面积（Y）作线性回归，得回归方程Y=15 080X+268 299（R2=0.999 7）。结果表明在11.32~566.50 μg/mL内的药物质量浓度线性关系良好。

2.3.3 方法学考察

精密度结果显示，同一份样品平行检测6次，峰面积的SRSD值为1.44%；稳定性结果显示，同一份样品在0，2，4，6，8，10，12和24 h内检测的峰面积值SRSD为1.29%；加样回收率结果显示，高，中，低浓度的青花椒精油加到样品中的加样回收率分别为97.66%，95.47%和96.22%；上述结果表明仪器参数相对良好，均符合规定，表明该方法可准确检测青花椒精油含量。

2.4 包封率的测定方法

采用超滤-离心法测定青花椒精油柔性脂质体的包封率。精密量取一定量的花椒精油柔性脂质体，加入适量乙腈破乳并稀释定容至5 mL，涡旋2 min，过0.22 μm微孔滤膜后，按2.3.1小节的色谱条件测定总芳樟醇的浓度。精密量取等量的柔性脂质体于超滤管上层套管中，在925g条件下离心15 min。收集下管滤液，用乙腈稀释定容至5 mL，过0.22 μm微孔滤膜后，按相同色谱条件测定游离芳樟醇的浓度。包封率EE（%）按式（1）计算。

式中：Ctota为脂质体中总芳樟醇的质量，mg；Cfree为脂质体中游离芳樟醇的质量，mg。

2.5 单因素考察

2.5.1 处方单因素

表面活性剂种类筛选结果（图1）显示：泊洛沙姆188和吐温80制备的脂质体粒径与包封率相当，考虑到吐温80有一定的毒性，因此选择泊洛沙姆188（F 68）作为表面活性剂；不同氢化大豆卵磷脂与胆固醇质量比和氢化大豆卵磷脂与F 68对脂质体粒径和包封率的响应趋势相似，即随着质量比增加，脂质体粒径呈下降趋势，包封率呈上升趋势，当氢化大豆卵磷脂与胆固醇质量比达到10∶1（或氢化大豆卵磷脂与泊洛沙姆188质量比达到8∶1）时，脂质体粒径呈上升趋势，包封率呈下降趋势；不同药物加入量结果显示，加药量的多少对包封率的影响小于对粒径的影响，药物加入量4 mg时粒径最小，包封的药物最多，更易于药物的吸收。

图1 处方单因素考察结果

2.5.2 工艺单因素

不同超声时间结果（图2）显示：当超声时间增加从5 min至10 min时，脂质体粒径下降而后随着时间延长，仍明显地降低脂质体粒径，说明适当延长超声时间能够有效地控制脂质体粒径；不同超声功率结果显示，超声功率对粒径的影响较大，可能是由于超声探头发出的能量受到粒子影响，在容器中分布不均匀，需要达到一定的超声功率，才能显著地降低脂质体的粒径，提高粒子的均匀度；不同水合时间和温度对脂质体粒径和包封率的响应趋势相似，观察脂质体包封率变化，结果发现随着水合温度上升，脂质体包封率增大，但水合温度过高，使磷脂膜结构变得松散，降低脂质体稳定性，导致药物渗漏。

图2 工艺单因素考察结果

图3 自变量A，B，C与因变量等高线图

2.6 Box-Behnken试验优化设计

2.6.1 Box-Behnken设计-响应面法优化试验

根据单因素试验，选择对青花椒精油柔性纳米脂质体影响较大的3个因素，即氢化大豆卵磷脂与胆固醇的质量比（A）、氢化大豆卵磷脂与泊洛沙姆188的质量比（B）和超声功率（C），每个因素取3个水平，设计三因素三水平Box-Behnken试验（见表1），以粒径（Y1）和包封率（Y2）为评价指标，优化精油脂质体工艺条件。采用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行处理，获得Y1与Y2值对自变量A，B，C的二次多项式回归方程：

表1 响应面试验设计因素与水平

表2 Box-Behnken试验结果

Y1=115.82+0.44A-0.062B-5.00C-0.48AB-0.25AC-1.20BC+5.88A2+5.93B2+9.70C2

Y2=91.27+0.62A+0.76B+2.3C+0.41AB+0.30AC-0.51BC-2.42A2-3.02B2-5.82C2

根据回归模型方差分析结果表3可知，各模型的P值均＜0.000 1，说明各回归模型极为显著。各模型的失拟项P值均＞0.05，表示异常因素对方程拟合的影响很小，可预测各因素对响应值的影响。相关系数R2分别为0.993 6和0.976 2，均＞0.9，说明各模型拟合程度较良好，模型的预测值与试验值相近，具有良好的相关性，可用于对柔性脂质体的预测和分析。进一步分析方程中的各项可知：C，BC，A2，B2，C2是Y1模型的显著性影响因素；C，A2，B2，C2是Y2模型的显著性影响因素。

表3 青花椒精油柔性脂质体方差分析结果

2.6.2 验证试验

根据Box-Behnken试验预测，当包封率最大，粒径最小时，最优工艺条件为氢化大豆卵磷脂与胆固醇的质量比10.2∶1、氢化大豆卵磷脂与泊洛沙姆188的质量比8.16∶1和超声功率为351.5 W，预测的包封率和粒径分别为91.57%和115.21 nm。根据实际工艺调整最优工艺条件：氢化大豆卵磷脂与胆固醇的质量比10∶1、氢化大豆卵磷脂与泊洛沙姆188的质量比8∶1和超声功率352 W，表4中所得柔性脂质体包封率和粒径与预测值的相对误差＜5%，SRSD＜2%，说明该试验设计具有良好的参考性和准确性。

表4 最优处方的验证试验

2.7 青花椒精油柔性纳米脂质体的质量评价

2.7.1 柔性脂质体外观

此研究制得的青花椒精油柔性脂质体外观如图4所示。通过肉眼观察，新鲜的柔性脂质体样品均为澄清，泛蓝光的溶液，用激光笔照射可以明显看到一条光亮的通路，证明所制备制剂为均匀的纳米制剂。

图4 青花椒精油柔性脂质体的外观

2.7.2 粒径和Zeta电位

采用Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪测定脂质体样品的粒径、多分散系数（PDI）及Zeta电位。结果表明，青花椒纳米柔性脂质体的粒径为115.81±2.11 nm（n=3），多分散系数PDI为0.236±0.110（n=3），Zeta电位为-50.21±2.35 mV（n=3）。此研究制得的青花椒油纳米柔性脂质体粒径分布均匀且稳定性良好，粒径分布及Zeta电位分布见图5。

图5 青花椒精油柔性纳米脂质体粒径（A）和电位（B）

2.8 体外经皮渗透

2.8.1 在离体皮肤制备

在小鼠腹部涂抹脱毛膏进行脱毛处理后，用生理盐水洗净，正常饮水饮食，饲养24 h后处死，用镊子剥离无毛的腹部皮肤，去除多余皮下脂肪，用生理盐水洗净，滤纸吸干，冷藏备用。

2.8.2 体外透皮吸收试验

采用改良的Franz扩散池测定青花椒精油柔性脂质体的渗透吸收规律。将备用的鼠皮从冰箱冷藏室中取出，恢复至室温，用滤纸尽可能将水分吸干。把鼠皮小心放于扩散池的供给池和接收池中间，角质层在供给池一侧，用夹子固定供给池和接收池，接收池内装满含20%（V/V）乙醇的生理盐水。取1.0 mL优化的柔性脂质体及相同质量浓度的原料药置于鼠皮上。在37±0.5 ℃恒温水浴中，调整转速为300 r/min进行透皮试验。于0，1，2，4，6，8，10，12，24和48 h取样0.2 mL，随即补等量37 ℃的20%（V/V）乙醇的生理盐水。取得的样品均用0.22 μm滤膜过滤，HPLC进样。从释放曲线（图6）看出，原料药在8 h时释放完全，柔性脂质体与原料药相比有明显促进药物吸收和缓释释放作用，48 h后纳米粒积累渗透量149.24 μg/cm2，是原料的1.77倍。

图6 青花椒精油柔性脂质体和原料药的体外渗透曲线

3 结论

添加表面活性剂制备的柔性纳米脂质体拥有比游离药物更好的释放特性，测得的粒径为115.81±2.11 nm（n=3），多分散系数为0.236±0.110（n=3），Zeta电位为-50.21±2.35 mV（n=3）。透皮试验结果显示，青花椒精油的累积释放量提高约1.77倍。同时有研究表明，纳米脂质体的Zeta电位绝对值越大，制剂越稳定[16]，进一步说明表面活性剂的添加还能提高青花椒精油柔性纳米脂质体的储藏稳定性。以纳米封装技术为基础的头透皮给药系统，不仅能够保护中药活性成分药物免受破坏，提高关键药物的稳定性，而且有利于对药物的摄取，提高中药活性成分药物吸收。