血清NT-proBNP、miR-431对川崎病伴冠状动脉损害的预测价值

王晓微, 付迎新, 赵淑清, 赵春华, 徐颖奇

(北京怀柔医院儿科, 北京 101400)

川崎病(Kawasaki disease,KD)又称皮肤黏膜淋巴结综合征,是一种急性自身免疫性疾病[1]。血管损伤,包括冠状动脉损伤,是KD的主要并发症之一,且KD现在已成为儿童获得性心脏病的主要病因之一,与成年后发生缺血性心脏病事件关系密切[2]。但由于KD临床表现与儿童时期的其他发热性疾病难以区别,其早期诊断仍然十分困难,临床中迫切需要新的特异性诊断生物标志物。MicroRNAs(miRNAs)是一种小的非编码RNA,长度约为21～25个核苷酸。通过与信使核糖核酸分子的互补结合,miRNAs可作为引导分子以多种方式下调基因表达[3]。MicroRNAs参与调节机体不同的发育阶段和病理过程。miRNAs以一种非常稳定的形式存在于人体血液中,并受到内源性核糖核酸酶(Ribonuclease, RNase)活性的保护[4]。研究发现,KD患者血清中miR-200C、miR-371-5P表达水平与患儿炎症水平显著相关[5];急性KD患者血液中miR-145呈高水平表达[6]。N末端B型利钠肽(N-terminal B-type natriuretic peptide, NT-proBNP)是由心肌细胞在外界刺激下产生的由32个氨基酸残基组成的多肽,其半衰期可达120 min,在体外表达水平相对稳定[7]。NT-proBNP对急性心力衰竭的诊断和预后判断有重要意义。在KD急性期,NT-proBNP水平急剧升高,是目前较为公认的KD诊断标志物[8]。本研究通过检测KD患儿外周血NT-proBNP和miRNA水平,探讨二者联合检测对KD合并冠状动脉损害的诊断价值,以期为临床KD伴冠状动脉损害的诊断提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2018年1月-2021年8月北京怀柔医院收治的选择168例KD患儿为研究对象(KD组),根据心脏超声结果,将KD组进一步分为冠状动脉损害组(CAL组,n=32)和非冠状动脉损害组(NCAL组,n=136)。同时,根据性别和年龄匹配原则,选择同期北京怀柔医院收治的170例上呼吸道感染患儿为对照组(NC组)。纳入标准:(1)KD患儿均符合美国心脏协会(American Heart Association, AHA)2017发表的关于KD的诊断标准;(2)首次诊断并治疗;(3)临床资料完整。排除标准:(1)合并其他自身免疫性疾病;(2)合并恶性肿瘤或感染性疾病;(3)采血前2周接受了激素、免疫抑制剂等治疗。所有监护人对本研究知情同意。本研究获北京怀柔医院伦理委员会批准,审批号:京怀伦科字(2023)第(03)-02号。

1.2 血液指标检测在静脉注射免疫球蛋白G治疗前采集患儿外周血样本,用乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝,在3 000 r/min、4℃条件下离心5 min,收集血清,并将其储存在-80℃。SYSMEX XE-2100 (F5192) 全自动血液分析仪检测白细胞计数(White blood cell count,WBC)、血红蛋白(Hemoglobin,Hb)、血小板计数(Platelet count,PLT);Roche modular DPP全自动生化仪检测C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、NT-proBNP、谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)、白蛋白(Albumin,ALB)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL);ALIFAX MICRO TEST1 血沉仪测定血沉(Erythrocyte sedimentation rate,ESR)。

1.3 下一代测序使用NanoPhotometer®分光光度计、Qubit®2.0荧光光度计和Agilent 2100 RNA Nano 6000分析试剂盒从患儿血清中提取总RNA。使用NextSeq测序平台上的SE50测序程序对合格的DNA文库进行测序,以获得高质量的序列读数。通过Bowtie对数据进行清理并与参考基因组进行比对,并使用miRDeep2软件鉴定miRNAs。DESeq分析得到差异表达的miRNAs,筛选标准为Q值<0.05,|log2foldchange|>1。

1.4 RNA提取及RT-PCR检测提取总外周血RNA。互补脱氧核糖核酸用M-Mul V逆转录酶在凸环miRNA-501、miRNA-520d-5p、miRNA-200、miRNA-15b和miRNA-451引物作用下合成。定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,QPCR)使用SYBR 试剂在CFX96实时PCR检测系统上进行,PCR反应重复进行3次。PCR反应条件为95℃变性20 s,然后95℃变性10 s,60℃变性20 s,70℃变性10 s,共40个循环。用U6对qPCR数据进行归一化处理。

2 结果

2.1 KD组与NC组的临床特征比较与NC组比较,KD组的WBC、PLT、CRP、ESR、ALT、NT-proBNP水平均较高,而HDL水平较低,差异有统计学意义(P<0.05)。但两组患儿的性别、年龄、Hb及ALB水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 CAL组与NCAL组患儿临床特征比较CAL组与NCAL组的性别、年龄、WBC、PLT、CRP、ALB、HDL、淋巴结肿大及手足硬肿发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05);与NCAL组患儿比较,CAL组患儿Hb、ESR、ALT、NT-proBNP水平显著较高,且发热时间明显更长,皮疹、结膜充血的发生率也更高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 CAL组与NCAL组患儿临床特征比较

2.3 儿童外周血miRNA表达谱鉴定与NC组儿童比较,KD患儿外周血共检测到149种差异表达的miRNAs,其中113种表达上调,36种下调(图1a)。层级聚类(图1b)显示,NC组与KD组患儿的miRNA图谱明显不同,10种miRNAs显著上调,3种miRNAs下调(P<0.05),表达水平差异≥2倍。其中,miR-100a、miR-431、miR-203分别上调3.4倍、3.1倍、2.9倍,是变化最为显著的miRNA。进一步行亚组分析发现,CAL组及NCAL组患儿外周血56种差异表达的miRNAs,其中42种表达上调,14种表达下调,其中,miR-431、miR-204-5p、miR-34a分别上调1.9倍、1.6倍和1.4倍,是变化最为显著的miRNA。最终,选择miR-431为进一步研究指标。

图1 下一代测序分析患儿外周血中差异表达的miRNAs图

2.4 患儿外周血差异性表达miRNAs的验证随机挑选5个miRNAs,即miRNA-501、miRNA-520d-5p、miRNA-200、miRNA-15b和miRNA-451,采用RT-PCR法检验5种miRNA在KD组和NC组患儿外周血的表达水平。PCR结果显示,与NC组比较,KD组患儿外周血miRNA-501、miRNA-520d-5p、miRNA-200表达水平明显升高,miRNA-15b、miRNA-451表达水平明显下降,与下一代测序结果一致。提示测序结果可靠。与NCAL组比较,CAL组患儿外周血miRNA-501、miRNA-520d-5p、miRNA-200表达水平明显升高,miRNA-15b、miRNA-451表达水平明显下降(P<0.05)。见图2和表3。

图2 RT-PCR检测两组患者外周血中差异表达的miRNAs图

表3 CAL组、NCAL组患儿差异表达miRNAs水平比较

2.5 患儿外周血NT-proBNP与miR-431表达的相关性CAL组、NCAL组患儿外周血中NT-proBNP与miR-431表达均呈正相关(r=0.765、0.536,P=0.003、0.018)。见图3。

图3 患儿外周血NT-proBNP与miR-431表达的相关性散点图

2.6 影响冠脉损伤发生的logistic多因素分析以是否发生冠状动脉损害为因变量,以各项检查结果为自变量进行多因素Logistic回归分析,结果显示,发热时间、NT-proBNP、miR-431均是影响KD患儿发生冠状动脉损害的独立性危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响冠脉损伤发生的Logistic多因素分析

2.7 NT-proBNP、miR-431对KD合并冠脉损伤的诊断价值ROC曲线显示,NT-proBNP、miR-431对KD合并冠脉损伤诊断的曲线下面积(Area under curve,AUC)分别为0.645、0.659,诊断敏感性分别为0.684、0.733,特异性分别为0.765、0.721,当二者联合检测时,可将AUC提高至0.799,见图4和表5。这表明,二者联合检测对KD合并冠脉损伤有较高的诊断价值。

3 讨论

KD会加速冠状动脉粥样硬化,甚至可能发生急性冠脉综合征和猝死[9]。miRNAs作为多种疾病的潜在生物标记物,例如miR-122-5p、hsa-miR-141-3p和hsa-miR-26b-5p对原发性胆汁性肝硬变具有较高的诊断准确性[10]。有研究报道,miR-92a-3p可能是区分KD与健康儿童的良好生物标志物[11]。

本研究结果显示,与NC组比较,KD组外周血miR-100a、miR-431、miR-203分别上调3.4倍、3.1倍、2.9倍,是变化最为显著的miRNA。与NCAL组比较,CAL组外周血miR-431、miR-204-5p、miR-34a分别上调1.9倍、1.6倍和1.4倍,是变化最为显著的miRNA。miR-431在各组患儿外周血的表达水平均有较高的区分度。研究表明,miR-431广泛了参与细胞凋亡、内皮型一氧化氮合酶表达和炎症等生物学过程[12];在动脉粥样硬化区域,氧化型低密度脂蛋白可上调miR-431表达促进内皮激活和动脉粥样硬化病变的发展[13]。提示,循环miR-431可能促进KD合并冠状动脉损害的发生。

心肌缺血、坏死、损伤、室壁张力和压力超负荷均可刺激心肌细胞大量释放前ProBNP,ProBNP被切割成proBNP和一个信号肽,前者移位到血液中,进一步被切割成NT-proBNP和BNP[14]。NT-proBNP具有较长的半衰期和较高的血药浓度稳定性,适合用于临床检测。研究表明,NT-proBNP水平能调节动脉粥样硬化的发展[15]。本研究的结果与上一致,miR-431和NT-proBNP表达呈正相关,且在KD患儿血清中表达上调。

综上所述,血清miR-431作为一种新的潜在生物标志物,与NT-proBNP联合检测对预测急性KD患儿是否发生冠状动脉损害具有较高的敏感性和特异性,可作为KD的一种新的生物标志物,并可能成为未来治疗的新靶点。