基于网络药理学推测当归肉苁蓉配伍治疗功能性便秘的作用机制

宋蕊蕊

（河南科技大学第一附属医院消化内科，河南 洛阳 471003）

功能性便秘（Functional constipation，FC）是全球高发疾病，指肠道功能紊乱导致机体出现大便干结、排便难、次数减少或排便不尽等症状，属中医学“便秘”、“阳结”或“阴结”范畴。西医治疗存在易复发，副作用大，长期疗效一般等缺点。中医治疗功能性便秘历史悠久，方法多样，主张辨证施治，整体调节脏腑气血阴阳，祛邪不伤正，标本兼治[1]。当归与肉苁蓉是治疗功能性便秘常用方济川煎的主要组成药物，二者也是数据挖掘治疗便秘常用方的经典药物组合前三名[2]。当归-肉苁蓉药对温肾益精，润肠通便，可用于老年人、久病体虚、妇人产后、温病后期等功能性便秘患者，但其作用机制尚不明确。此外，FC发病原因复杂，与饮食、生活习惯、自主神经功能异常、药物或年龄等相关，给其作用机制探讨带来更大困难。

网络药理学结合药物、成分、作用靶点和疾病靶点信息，多角度、多方面探索药物和疾病之间的分子关联，从而更好的揭示药物治疗疾病的分子机制[3]。尤其是在中医药研究中，网络药理学与中医整体观不谋而合，从而探讨中药多成分、多靶点、多途径治疗疾病的方式。本文借助网络药理学方法，探讨当归肉苁蓉对FC的治疗作用及机制，为其临床应用提供理论依据，并为后期试验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 当归-肉苁蓉化学成分、对应靶点和功能性便秘疾病靶点的筛选

基于TCMSP数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）检索当归和肉苁蓉的化学成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug-like properties，DL）≥0.05作为条件，筛选当归和肉苁蓉的活性成分。基于TCMSP、STITCH（http://stitch.embl.de/）等数据库收集当归-肉苁蓉活性成分对应靶点，并于Uniport（https://www.uniprot.org /）数据库转换基因名，去重。

GeneCards数据库（http://www.genecards.org）检索“functional constipation”，获得FC疾病靶点。

1.2 药物-活性成分-靶点网络构建和生物信息学分析

采用Cytoscape 3.7.0软件进行“当归-肉苁蓉-活性成分-靶点网络”的构建，以度（degree）≥6为阈值筛选，得到“当归-肉苁蓉-活性成分-靶点网络”。DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行当归-肉苁蓉成分靶点的基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

1.3 药物-活性成分-共有靶点网络构建

收集当归、肉苁蓉活性成分和FC疾病靶点的交集靶点，称共有靶点，Cytoscape 3.7.0软件构建“当归-肉苁蓉-活性成分-FC共有靶点网络”。

1.4 关键基因筛选和蛋白互作网络构建

于STRING数据库（https://string- db.org/）检索共有靶点，收集蛋白互作信息，CytoNCA插件基于点度中心性（Degree Centrality，DC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC）、中介中心性（Betweenness Centrality，BC）筛选关键基因，进行关键基因的蛋白质互作网络（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）构建[4]。

1.5 当归-肉苁蓉治疗FC的关键基因生物信息学分析

DAVID数据库进行当归-肉苁蓉治疗FC的关键基因的GO功能和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析以P＜0.01，count≥5为阈值，KEGG通路富集分析以P＜0.01且count≥10为阈值。

2 结果

2.1 当归-肉苁蓉的活性成分收集

共检索到当归化学成分125个，肉苁蓉化学成分75个。其中，OB≥30%和DL≥0.05的当归活性成分25个，肉苁蓉13个。最终得到无重复且有相应靶标的活性成分39个，见表1。

表1 当归和肉苁蓉的主要活性成分

2.2 药物活性成分靶点和FC疾病靶点的收集

数据库收集到当归活性成分相关靶点56个，肉苁蓉活性成分相关靶点143个，交集靶点16个。FC疾病靶点5199个，其中，Relevance score≥3的靶点为2428个。当归、肉苁蓉与FC三者交集靶点13个，当归-肉苁蓉药物靶点与FC疾病靶点交集靶点132个，见图1。

图1 药物与疾病靶点韦恩图

2.3 当归-肉苁蓉的药物成分-靶点网络和生物信息学分析

“当归-肉苁蓉-活性成分-靶点网络”包含276个节点和330条边。网络中，当归-肉苁蓉共有活性成分β-谷甾醇，肉苁蓉活性成分槲皮素，当归活性成分豆甾醇、阿魏酸、菖蒲二烯等degree值高，提示这些成分可能为当归-肉苁蓉配伍中的主要有效成分。

前列腺素内过氧化物合成酶（Prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase，PTGS2、PTGS1）、γ氨基丁酸A受体（Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Subunit Alpha1，GABRA1）、毒蕈碱型胆碱受体（Muscarinic Acetylcholine receptor，CHRM2、CHRM1、CHRM3）、去甲肾上腺素转运体基因（Sodium-dependent noradrenaline transporter，SLC6A2）、细胞肿瘤抗原p53（Cellular tumor antigen p53，TP53）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase，CASP）和分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）等靶点的degree值较高，提示这些靶点可能在当归-肉苁蓉配伍中起主要作用，网络中degree值排名前20的当归-肉苁蓉相关成分和靶点见表2。对当归-肉苁蓉的靶点富集分析结果显示，药对靶点的GO功能主要富集在细胞外空间、质膜组成、核质等细胞成分，酶结合、RNA聚合酶II转录因子活性、类固醇激素受体活性等分子功能，炎症反应、凋亡过程的负调控、血管收缩的正向调节等生物学过程，均与FC疾病机制相关，提示当归-肉苁蓉药对可用于FC等胃肠道疾病的治疗，见图2。

图2 当归-肉苁蓉药物靶点GO功能富集结果

表2 当归-肉苁蓉-活性成分-靶点网络重要节点

2.4 当归-肉苁蓉治疗FC的药物-活性成分-共有靶点网络和关键基因筛选

“当归-肉苁蓉-活性成分-FC共有靶点网络”共有146个节点和226条边。β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇、阿魏酸等成分的degree值高。PTGS2、PTGS1、GABRA1、CHRM2、CHRM1、CHRM3和SLC6A2等靶点的degree值较高，提示这些靶点可能在当归-肉苁蓉治疗FC中起主要作用，见图3。CytoNCA插件按DC≥44、CC≥48.415613、BC≥0.517432975为阈值筛选，最终得到关键基因74个，PPI网络有节点74个，边1334条。AKT蛋白激酶（Threonine-protein kinase，AKT1）、血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、转录因子（Transcription factor Jun，JUN）、TP53、CASP和MAPK等节点degree值大，结合分数高，在网络最中心，预测为当归-肉苁蓉治疗FC的潜在关键靶点，见图4。

图3 当归-肉苁蓉-活性成分-FC共有靶点网络（节点大小与degree值成正比）

图4 当归-肉苁蓉治疗FC的关键基因PPI网络

2.5 当归-肉苁蓉治疗FC的关键基因的生物信息学分析

关键基因GO分析的结果可知，当归、肉苁蓉配伍治疗功能性便秘的机制多与缺氧的反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、凋亡过程的负调控、类固醇激素受体活性等多个生物过程和分子功能有关，见图5。KEGG 通路主要有TNF信号通路、HIF-1信号通路、p53信号通路、PI3KAkt 信号通路、MAPK信号通路等，见图6。

图5 GO功能富集分析

图6 KEGG通路分析

3 讨论

FC多与患者生活习惯、精神因素、肠道菌群失调、胃肠激素和神经递质异常等有关，病程长且治疗难度大[5]。西医药物治疗存在疗效欠佳，易引起复发，易形成依赖性等缺点[6]。中医用以活血养血、滋阴补阳、疏肝健脾、润肠通便的中药，改善患者阴虚血虚、肝气郁结、脾胃不和等状态[7]。当归-肉苁蓉为治疗FC常见药对，当归滋阴生血，补血活血，润肠通便；肉苁蓉补肾壮阳，滋阴养血，软坚通便。二者配伍，行中有补，补而不峻，起到调肝养血，润肠通便的功效。因此，本研究基于网络药理学技术进行了当归-肉苁蓉药对配伍治疗FC作用机制。的

最终收集到当归-肉苁蓉药对活性成分39个，成分相关靶点237个，FC疾病靶点2428个。其中，当归-肉苁蓉药对靶点与疾病靶点的交集靶点132个，筛选到关键基因74个。β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇、阿魏酸等成分可能是药对治疗FC的活性成分，β-谷甾醇为当归-肉苁蓉的共有活性成分，具有抗炎、抗氧化、抑菌等作用[8]。研究表明，β-谷甾醇和豆甾醇可改善小鼠实验性结肠炎，保护大鼠胃和十二指肠，预防消化性溃疡[9]。改善功能性便秘可通过减少炎症反应实现[10]。PTGS与胃肠道功能关系密切，是炎症反应的主要介质[11]。PTGS2在慢性和急性炎症反应中明显上调，可加重胃肠道毒性。在机械性肠梗阻模型中，表达上调甚至诱发结直肠癌发病[12]。AKT1依赖PI3K途径激活，对PI3K-AKT 通路的激活，可影响肠道传输功能从而参与功能性便秘、慢性传输性便秘等多种便秘[13]。

TP53信号通路、MAPK信号通路和NF-κB信号通路已被报道与功能性便秘发病机制密切相关[14-15]。MAPK信号通路通过调节水通道蛋白的表达，促进水分运输，调节慢性传输型便秘大鼠结肠水代谢平衡[16]。

综上所述，本研究基于网络药理学技术分析，发现当归-肉苁蓉可能通过β-谷甾醇、豆甾醇、阿魏酸等关键活性成分，作用于PTGS2、AKT1、TP53、CASP和MAPK等核心靶点，参与TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等，发挥其多成分、多靶点、多通路治疗FC的作用，为深入研究其作用机制提供了理论依据和思路。