苯丙氨酸脱氢酶分离纯化的开放实验教学设计与实践

李进军 赵 晨 王辂 李端华

关键词：苯丙氨酸脱氢酶；纯化；开放实验；教学设计与实践

苯丙氨酸脱氢酶（Phenylalanine Dehydrogenase，PheDH）可以催化苯丙氨酸转化为苯丙酮酸。苯丙氨酸脱氢酶异常会导致苯丙氨酸代谢紊乱，进而引发苯丙酮尿症等疾病。苯丙氨酸脱氢酶在医学和生物技术领域有着广泛的应用，如苯丙酮尿症的诊断、治疗和预防[1]以及高价值氨基酸和药物类多肽等的合成[2]。

苯丙氨酸脱氢酶是本课题组研究较为深入的酶类。其中，李进军等[3]用双水相方法纯化苯丙氨酸脱氢酶，提供了一种简便、有效、绿色的纯化策略，收率和纯度都达到了较高水平；夏羽行等[4]在双水相纯化的基础上用离子纯化得到高纯度酶，并研究了酶学性质相关内容。

在生源方面，成都大学药学院本科生生源较好，录取分数在重本以上，有较好的学习能力且有极大可能继续升学研究，即使是本科毕业直接工作，也有必要开设开放实验课程，不仅能培养学生的大局观，使其了解本科所学知识在一个项目层级中扮演的角色，还能让学生在找工作时提前锚定自己的兴趣点，避免盲目选择。

本开放实验的特点在于脱胎于整个实际项目并合理简化，以实现本科层次的教学目的，旨在培养学生的项目观念，为学生完成毕业设计、本科毕业后工作以及继续深造奠定基础。

1 实验设计

1.1 实验目的

了解整个项目的内容和流程，熟悉摇床发酵、超声破壁、双水相提取、手动装柱和纯化、高效液相色谱（HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC）分析和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析等实验操作步骤，系统训练学生搜寻文献、设计实验内容、分析实验数据、撰写报告等方面的能力。

1.2 课程安排

课程具体安排如表1所示，课程设计按照内容逻辑安排，实操时可根据实际情况拆分。

1.3 仪器与试剂

高效液相色谱仪（E2695型，Waters公司；LC-2010A，日本岛津公司）；微孔板分光光度计（Epoch，Biotek公司）；电泳仪（Bio-Rad公司）；超声破碎仪（JYD-650L，上海之信仪器公司）；半制备液相色谱系统（日本岛津公司）；多通道蠕动泵（保定雷弗）；冷冻离心机（J-26XP，美国BECKMAN公司）；数显恒温振荡器（SHA-B，常州澳华仪器公司）；制冰机（IMS-20，常熟市雪科电器有限公司）。

酵母浸粉、胰蛋白胨（OXOID公司）；IPTG、Bradford试剂及氨苄西林（生工生物工程公司）；苯丙氨酸；PEG 4000、硫酸铵、磷酸氢二钾、氯化钠、EDTA、β-巯基乙醇（科龙化学试剂公司）；NAD+、NADH（Amersco公司）；Q-FFSepharose（GE公司）；色谱甲醇、色谱乙腈（Swell）；其他化学试剂均为分析纯，水为去离子水。

2 课程实践

2.1 文献查阅及方案设计

（1）指导学生使用学校数据库，并鼓励学生通过校外途径获取更多文献资源；（2）培养学生提取关键词的能力，如本实验中的“苯丙氨酸脱氢酶”“离子柱纯化”“双水相萃取”以及“柱效测定”等；（3）教会学生高级检索、检索结果排序、在结果中进一步检索等手段；（4）教会学生選定特定来源的文献，如特定机构、高校、院所发表的文献，或被北大核心期刊库、SCI等收录的文献；（5）教会学生追踪并细化检索该领域的活跃单位及个人。

让学生了解如何寻找各类具体技术的参考源，如相关工具书、搜索引擎、学术博客、专利、仪器耗材厂家技术支持等。

学生阅读、总结文献后，结合本课题研究内容，以小组为单位设计实验方案，内容包括材料、仪器、方法等，教师批阅后再次修改，最终形成完整的实验方案，指导教师对小组方案作出分析和评价。

2.2 种子培养，诱导摇瓶培养

实验前，教师需要讲解的内容有：（1）菌种来源，重点是用于转化株的筛选、不容易染菌等抗性基因的作用以及菌种库的建立和使用；（2）超净台操作规范，重点讲解接种的操作要领；（3）摇床发酵，重点讲解溶解氧、剪切力等与转速和摆放位置的关系；（4）产物诱导，重点讲解异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside，IPTG）诱导原理以及温度的影响；（5）大型离心机的使用，重点阐述配平规则，强调安全事项。

实验内容：（1）取出甘油管冻存的菌种，解冻后接种至种子培养基过夜培养；（2）过夜种子接种于装有发酵培养基的灭菌摇瓶中，培养至特定菌体浓度后，加入IPTG诱导20 h；（3）离心，将菌体沉淀置于﹣20 ℃冰箱中保存备用。

2.3 样品提取，样品粗纯

样品提取和粗纯是纯化工作中的重要步骤，决定了实际可得产量，并严重影响后续纯化策略的实施。

实验前教师需要讲述的内容有：（1）胞内表达和胞外表达、可溶表达和包涵体表达的区别；（2）破壁方式，重点讲述化学破壁、物理破壁以及超声破碎仪的使用方法；（3）双水相原理，重点讲述分相原理和霍夫梅斯特序列（Hofmeister series）。

实验内容：（1）将菌体解冻，用缓冲液重悬；（2）在冰浴条件下超声破碎，离心后得到澄清的粗酶液以备纯化；（3）将上清酶液加入配制好的双水相体系中，振荡后低速离心，将萃取层置于﹣20 ℃下以备后续纯化。

2.4 色谱柱装填，测定柱效

色谱柱作为液相分析的核心，对分离分析有重要影响，而色谱柱的效果主要由填料和装填技术决定，尤其是前者，其发展和革新贯穿于整个液相分析技术的发展历程并起到决定性作用。手动装填色谱柱能让学生更加深刻地理解液相层析柱的原理和本质，故采用手动装填色谱柱的方式。

实验前需要复习和讲述的内容有：（1）色谱学的平衡理论、塔板理论以及最重要的速率理论，因为其不仅提出了范第姆特方程式，还引入了柱效、分离度等重要概念；（2）作为液相系统的核心，色谱柱的构造和组成包括柱体、填料、密封环；（3）作为色谱柱的核心，填料的基质主要分为硅胶、多糖基软胶（琼脂糖和葡聚糖）、聚合物硬胶（聚苯乙烯和聚苯烯酸酯）。通过化学法偶联各种基团（如磷酸基、季铵基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体，衍生出种类繁多的色谱柱类型，如正向色谱柱、反相色谱柱、亲水色谱柱、疏水色谱柱、离子交换色谱柱、亲和层析色谱柱、体积排阻色谱柱等，为多种多样的化合物分离提供可能。

实验内容：（1）每组分发100 mL QFF离子交换树脂，每人分发一根10 mL Flash空柱，在教师的指导下装填；（2）将色谱柱接至蠕动泵，以20%乙醇为流动相，流速渐增到5 mL/min，维持10 min以压紧填料；（3）手动装柱经验性较强，个人差异大，故所装填色谱柱需要进一步测定柱效，评价装柱质量和水平，柱效通常用理论塔板高度（Height Equivalent of Theoretical Plate，HETP）和非对称因子（Asymmetric Factor，As）来评价。

2.5 离子柱精纯，酶活分析

亲手搭建简易多通道色谱系统能让学生更深刻地领悟色谱系统的组成及作用。采用多泵头蠕动泵作为液体传输系统能同时操作多个色谱柱层析，大大降低设备成本和时间成本。采用手动装填色谱柱为层析柱，按照传统的梯度洗脱和分步收集方式纯化和收集样品。蛋白浓度和酶活的分析均采用超微量微孔板分光光度计来实现，都要建立标准曲线，好处是可单次检测多个样品，且耗时短、消耗试剂少。蛋白浓度测定采用Bradford方法（BSA为标准蛋白），酶活检测依据NADH在340 nm的减少量来计算，定义每分钟消耗1 mol/L NADH的酶量为1个酶活单位（U）[5]。

实验前，教师应讲述的内容有：（1）简易色谱系统的搭建。虽然是简易色谱系统，但仍旧包含输液系统、进样系统、分离系统、收集系统、检测系统；（2）梯度洗脱方式和分布收集方式的具体操作方法；（3）超微量微孔板分光光度计的使用步骤；（4）蛋白浓度和酶活检测原理以及比活性（酶活力/蛋白浓度）和纯化倍数（纯化后酶比活性/纯化前酶比活性）等相关重要参数。

实验内容：（1）连接色谱柱和蠕动泵，准备好流动相和接样瓶；（2）用平衡液平衡色谱柱；（3）采用泵吸入方法上样；（4）盐浓度梯度洗脱，分步收集；（5）检测各梯度洗脱液的蛋白含量；（6）检测各梯度洗脱液的酶活；（7）选择酶活最高的组分，冻存后以备后续分析。

2.6 HPLC分析，SDS-PAGE分析

在进行高效液相分析前，教师应参照前面搭建的液相系统对比讲解，让学生更深入地了解液相色谱的构造、原理及作用，杨卫灵等[6]基于HPLC测定氨基酸的开放实验很有参考价值。

HPLC分析实验内容：（1）样品前处理，参照2.3提取并粗纯样品，强调前处理的重要性，若操作不當，会造成样品失真、样品污染、色谱柱堵塞等；（2）液相方法的编辑，包括洗脱梯度、温度、最高压力、最低压力及检测波长等参数的设定；（3）样品序列编辑，用批处理来说明高效液相色谱对人力的解放和生产力的提高作用；（4）数据批量处理，包括数据处理方法的设置、结果和报告的批量导出。

在SDS-PAGE操作前，讲解SDS-PAGE的基本原理：

（1）说明β-巯基乙醇、SDS、溴酚蓝（BPB）等试剂的作用；

（2）重点阐述浓缩胶、分离胶的制备及所起作用和原理。

SDS-PAGE分析实验内容：（1）样品前处理，根据目的选择还原或非还原Loading Buffer。根据样品性质选择沸水浴、温水浴或者直接上样，同时要注意样品是否含有高浓度盐或Triton等能产生严重干扰的化学物质。（2）上样、电泳。根据样品浓度合理稀释，样品量过多、过少均会影响跑胶效果；小心加样，既不能破坏加样孔，也不能使样品溢出加样孔；设定好既定程序开始电泳。（3）染色、脱色。等待示踪染料溴酚蓝跑至胶末端，同时关注Marker情况，结束后关闭电源，去除浓缩胶后将分离胶染色40 min，再脱色1 h，并换脱色液2～3次。（4）用Image Lab分析主条带纯度[7]。

2.7 数据处理

收集并整理各步骤相关数据，推荐使用Excel编排，学会剔除异常数据，采用函数公式计算均值、方差、标准差和相对标准偏差；学会绘制标准曲线图，得出线性公式；学会绘制散点图、柱状图、双Y轴图。

2.8 报告撰写

以小组为单位，严格依据模版格式撰写报告，按国标GB/T 15834—2011规范使用标点符号，表头、图注的格式保持全文统一，做到数据真实、内容完整、行文流畅、逻辑清晰。根据数据讨论结果产生的原因，并对后续实验改进提出建议。最后总结该开放实验教学课程，写出自己的进步、感悟和所得。

3 结语

通过开放实验教学，学生不仅能了解发酵、提取、粗纯、精纯、分析整条链的内容，使本科教学知识点融为一体，还能通过文献调研、数据分析和报告撰写进一步提升科研水平，对本科毕业设计、就业和升学深造都大有裨益。