网络药理学结合分子对接研究通窍活血汤治疗阿尔茨海默病的潜在分子机制

江张胜，董 婷，田丽伟，赵晨玲，闻雨雅，陈 洁

（1.安徽中医药大学 研究生院，安徽 合肥 230038 ; 2.安徽中医药大学第一附属医院 脑病科，安徽 合肥 230031）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种最为常见的痴呆类型，主要临床表现为多种认知功能障碍和年龄依赖性记忆丧失。目前，胆碱酯酶抑制剂通常用于改善AD 患者的认知功能[1]，但这些药物只能缓解疾病，而不能逆转疾病的进展。相关研究表明，AD 的病因可能与一系列复杂的因素有关，如遗传、脑梗、糖尿病等[2]。在病机复杂的疾病中，对“多组分、多靶点”药物作用机制的研究具有重要意义。

在中医上，AD 常被归类为“痴呆”，由脑髓虚邪、扰乱脑孔所致[3]。研究表明，中医运用补虚、开窍、化瘀活血法等治疗AD，疗效可靠[4]。通窍活血汤乃出自清代著名医家王清任的《医林改错》，方中赤芍活血散瘀、清热消肿；川芎行气活血、祛风止痛，二药配伍更增行气活血而通脑络之功；葱白通阳理气，大枣补脾益气、养血安神、调和药性；红花散瘀止痛、活血通经；生姜提神醒脑、通利血脉；桃仁破血行瘀、润燥滑肠，诸药合用具有活血祛瘀与通窍活络等诸多功效[5]。现代药理学研究表明，通窍活血汤可能通过抑制血管因子ET-1、促进VEGF 的生成和促进海马神经细胞的修复，从而改善VD 大鼠的学习记忆能力[6]。目前研究主要汇集于对临床疗效观察和动物实验来验证某种药物治疗疾病的作用机制研究，缺乏药物活性成分和疾病之间的靶向分子机制研究。网络药理学作为一个多成分、多靶点的学科体系，在研究复杂的分子机制方面有其独特的优势[7-8]。本研究将运用网络药理学并结合分子对接技术，研究通窍活血汤治疗AD 的潜在分子机制，为临床治疗AD 提供参考。

1 方法

1.1 通窍活血汤化学成分的筛选及靶点的获取

借助中药系统药理学分析平台TCMSP[9]，以通窍活血汤中的主要药物（赤芍、川芎、葱白、大枣、红花、生姜、桃仁）为关键词检索通窍活血汤中的作用靶点，采用生物口服利用度（OB）≥30%以及类药性指数（DL）≥0.18 为成分筛选条件[10]，过滤出通窍活血汤中有效化学成分及与之相应的潜在预测靶点，将所取得潜在靶点名称通过UniProt[11]数据库转换成标准基因名，得到相应人类基因。

1.2 疾病相关靶点获取

通过GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD 数据库，以“Alzheimer’s disease”为检索词进行检索，将所得基因合并且删除重复，最终确定AD 靶点基因。

1.3 通窍活血汤与AD 交集靶点的筛选及“化学成分-交集靶点”网络构建

将通窍活血汤的基因靶点和AD 的靶点数据上传到Veen 在线作图工具进行分析后，得到二者的交集靶点。采用Cytoscape3.7.2 软件构建通窍活血汤和AD 之间的“化学成分-交集靶点”网络图，同时筛选出其关键作用成分。

1.4 通窍活血汤与AD 交集靶点蛋白质互作（PPI）网络的构建及核心靶点筛选

将通窍活血汤与AD 的交集靶点上传到String 数据库，后将其进行PPI 网络可视化分析，设定物种为Homo Sapiens，最低置信度为0.9，同时隐藏游离节点，构建PPI 网络图，下载相应.tvs 文件。采用Cytoscape3.7.2 软件中的CytoNCA 插件对PPI 网络进行拓扑分析。其中，分析内容为DC，筛选DC 值大于2 倍DC 中位数值的节点，便获得核心靶点[12]。

1.5 GO 富集分析与KEGG 信号通路的构建

借助DAVID 数据库（取P＜0.05 为截止值）进行GO 生物功能和KEGG 通路富集分析。利用R4.0.3软件将获取结果进行可视化处理，获取化学成分与疾病的交集靶点功能及其在信号通路中的作用机制。

1.6 通窍活血汤-主要通路-AD 分子对接

采用分子对接法评价AD 靶标与通窍活血汤之间的相互作用。从蛋白质数据库中获得蛋白质晶体结构，采用PubChem 化合物数据库获取该化合物的3D结构，经Pymol 软件进行水分子去除及受配体分离后，采用AutoDockTools 1.5.6 软件被用来将氢加到蛋白质中。将蛋白质和配体转化为.pdbqt 格式，采用AutoDock Vina1.1.2 软件进行分子对接。结合亲和力＜0 kcal/mol 表示配体能与受体结合；结合亲和力值≤-5.0 kcal/mol 显示较好的结合能力[13]。

2 结果

2.1 通窍活血汤主要化学成分

通过 TCMSP 数据库进行收集，获取通窍活血汤的潜在有效成分共127 个，其中，桃仁23 个、红花22 个、川芎9 个、赤芍29 个、葱白10 个、生姜5个、大枣29 个（OB值排名前20 的药物化学成分见表1）。将靶点名称上传到UniProt 数据库，设定物种为 “Homosapiens”，校正靶点的标准基因名并删除重复，最终得到265 个靶基因。

2.2 AD 相关靶点获取结果

通过GeneCards、OMIM、Drugbank 和TTD 数据库。以“Alzheimer’s disease”为关键词，检索与AD 相关的作用靶点，得到有关AD 的靶点2 189 个，其中，GeneCards 以中位数进行筛选，最终筛选1 433 个，OMIM 543 个，Drugbank 65 个，TTD 148 个。将所获得的基因靶点进行合并并剔除重复，最终得到靶点2 000个，见图1。

图1 AD 靶点图Fig.1 AD target map

2.3 “通窍活血汤-AD-成分-靶点”可视化网络

将通窍活血汤的基因靶点和AD 的靶点数据进行分Veen 析后，获取二者交集靶点156 个，见图2。利用Cytoscape3.7.2 软件构建通窍活血汤和AD 之间的“成分-靶点”多向性网络图，共有339 个节点，1 462 条边。以大于节点度值的两倍进行不断筛选，得到排名前三个化合物，依次为槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇，其度值分别为304、190、128，这些化合物可能在通窍活血汤治疗AD 中起主要作用，见图3。

图2 AD 与通窍活血汤交集韦恩图Fig.2 Venn diagram of intersection of AD and Tongqiao Huoxue decoction

图3 中药有效成分-靶点图Fig.3 Target diagram of TCM active components

2.4 通窍活血汤与AD 交集靶点蛋白质互作（PPI）网络的构建及核心靶点筛选

将通窍活血汤与AD 的靶点交集导入到String数据库中进行PPI 分析，结果显示有129 个节点和对应的567 条网络。采用Cytoscape3.7.2 软件中的CytoNCA 插件对PPI 网络进行拓扑分析，得到关联性最强的10 大核心靶点，分别为JUN、AKT1、TP53、RELA、CTNNB1、MAPK1、TNF、MAPK14、FOS 和IL6，见图4。

图4 通窍活血汤对血管性痴呆作用靶点的PPI 网络图Fig.4 PPI network diagram of target of Tongqiao Huoxue decoction on vascular dementia

2.5 GO 富集分析与KEGG 信号通路和通窍活血汤-主要通路-AD 进行网络构建

借助DAVID 数据库进行GO 富集分析，获取GO条目2 836 个，其中生物过程（BP）有条目2 544 个，细胞组成（CC）有条目103 个，分子功能（MF）有条目189 个（选取条件为P＜0.05），结果显示，通窍活血汤与AD 的交集基因的GO 富集分析的BP 主要集中在RNA 聚合酶II 启动子的转录正调控、基因表达的正向调控、信号转导等；CC 主要集中在胞质、等离子体膜、细胞核等；MF 主要集中在结合蛋白、同一结合蛋白、酶结合等，见图5。

图5 通窍活血汤治疗AD 的GO 生物功能富集气泡图Fig.5 GO biofunctional enrichment bubble diagram of Tongqiao Huoxue decoction for AD

利用DAVID 数据库对其进行KEGG 通路富集分析，以P＜0.05 为筛选条件，结果得到KEGG 信号通路177 条，部分结果如下，发现通窍活血汤治疗AD 的潜在作用通路为脂质与动脉粥样硬化信号通路、AGE-RAGE 信号通路、PI3K-AKT 信号通路、TNF 信号通路等，见图6。

图6 通窍活血汤治疗AD 的KEGG 信号通路富集气泡图Fig.6 Bubbles enrichment in KEGG signaling pathway in the treatment of AD by Tongqiao Huoxue decoction

2.6 通窍活血汤-主要通路-AD 分子对接

将所得前三个关键成分与前三个关键靶蛋白的分子进行对接，结果见表2、图7。结果显示，JUN与槲皮素的结合性最好，提示通窍活血汤的活性成分在治疗AD 中发挥的作用较大。

图7 活性成分与核心靶点的分子对接图Fig.7 Molecular docking diagram of active ingredient and core target

表2 活性成分与核心靶点的结合能Tab.2 Binding energies of active ingredients and core targets

3 讨论

通窍活血汤具有活血祛瘀与通窍活络之功效，其有效成分槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等均为网络中的重要节点，同时它们多属于桃仁与红花，体现了君药在方剂中的关键作用。现代药理学研究表明，这些成分均有一定的抗炎、抗氧化功能，从而发挥改善记忆的作用，在防治AD 中扮演着关键角色[14-16]。

由PPI 网络图谱可以看出，JUN、AKT1、TP53等在疾病的治疗中可能处于核心地位，经过分子对接验证，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇与度值较高的靶点分子之间具有较好的结合性，体现了通窍活血汤在AD 的防治上具有多成分和靶点多向性的特点。基础研究表明，JUN 主要与免疫、细胞增殖、凋亡抑制等信号通路密切相关，对蛋白合成以及细胞代谢至关重要，并且此通路的活化与细胞炎症反应有密切联系[17]。AKT1 作为PI3K-AKT 信号通路中的关键信号因子，广泛参与细胞的炎症反应过程，同时调控细胞的增殖与生长[18]。MAPK1 属于整合信号因子，可被炎症因子及细胞氧化损伤等激活，是调控细胞增殖、分化、炎症、凋亡等信号的关键靶点，并且下调MAPK1 可以改善AD 小鼠的认知情况[19-20]。研究发现，TP53 既参与细胞增殖、衰老、DNA 修复和细胞死亡的严格控制，也参与调控FXN，进而导致神经细胞的凋亡，与认知功能障碍关系密切[21]。TNF、IL-6 作为重要的细胞炎性因子，主要参与调节细胞炎性反应，同时与AD 的发病密切相关[22]。表明通窍活血汤中各药材在AD 治疗中的协同作用，体现了中药多成分协同保护神经的特性。

结合GO 生物功能富集分析，通窍活血汤还可通过多系统多途径起到治疗AD 的作用。其生物过程主要集中在RNA 聚合酶II 启动子的转录正调控、基因表达的正向调控、信号转导等；细胞组分主要聚集在胞质、等离子体膜、细胞核等；分子功能主要汇聚在结合蛋白、同一结合蛋白、酶结合等。提示通窍活血汤可能通过转录调控细胞信号转导、细胞膜转运以及相应蛋白结合等过程发挥疗效。KEGG 信号通路分析通窍活血汤治疗AD 主要通过脂质与动脉粥样硬化、AGE-RAGE、PI3K-AKT、TNF 信号通路有关。有研究发现，PI3K- AKT 信号通路调节细胞增殖、运动、存活、代谢等多种生物学过程的功能，抑制多种神经毒性机制，这些刺激与淀粉样β、神经纤维缠结和脑萎缩密切相关[23]，调节PI3K- AKT 信号通路能够有效改善AD 大鼠的学习记忆能力[24]。TNF 信号通路参与许多系统性慢性炎症和退行性疾病，是神经炎症的关键介质之一。TNF 与TNFR1 和TNFR2 受体结合，以激活不同的细胞反应，可以是神经保护或神经变性。特别是TNF 可以在炎症环境中诱导程序性坏死或坏死性凋亡。有研究表明，AD 患者死后脑的CA1锥体神经元中TNF/TNF 受体-1 介导的坏死性凋亡通路中多种蛋白的表达增加，如RIPK3 和MLKL 的磷酸化表达增加[25]，由此可知，通窍活血汤可能通过作用于AGE-RAGE、PI3K-AKT、TNF 信号通路参与调整细胞周期，介导炎症反应等途径发挥神经保护的作用机制，但临床却鲜有报道，故需进一步实验验证。

综上可知，本研究主要通过网络药理学的方法对通窍活血汤治疗AD 的潜在分子靶点和干预机制进行预测，结果显示通窍活血汤主要通过槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等活性成分作用于JUN、AKT1、TP53、RELA、CTNNB1、MAPK1、TNF、MAPK14、FOS、IL-6 等靶点经脂质与动脉粥样硬化信号通路、AGE-RAGE 信号通路、PI3K-AKT 信号通路、TNF信号通路等，对基因转录翻译以及细胞膜转运过程发挥作用，达到治疗AD 的效果。并且使用分子对接技术对预测结果进一步验证，验证了通窍活血汤的活性成分作用于AD 疾病靶点目标的可靠性，为进一步研究其具体的作用机制奠定了一定的理论基础。

4 结论

本研究基于网络药理学和分子对接技术发现通窍活血汤治疗阿尔茨海默病的活性分子主要为槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等，并与核心靶点JUN、AKT1、TP53 有较好的结合性，通过调控AGERAGE、PI3K-AKT、TNF 等信号通路来降低活性氧簇水平，减轻神经炎症反应，抑制神经细胞凋亡，发挥其保护神经细胞、改善认知的作用，为后续进行相关的基础实验提供一定的理论基础。